Overview
תיוג מטבולי משמש כדי לחקור את התמורות הביוכימיות ושינויים המתרחשים בתא. זה מושג באמצעות אנלוגים כימיים המחקים את המבנה של biomolecules טבעי. תאים משתמשים באנלוגים בתהליכים הביוכימיים האנדוגניים שלהם, ומייצרים תרכובות המסומנות. התווית מאפשרת שילוב של תגי זיהוי זיקה, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם כדי לפרט מסלולים מטבוליים באמצעות טכניקות אנליטיות ביוכימיות אחרות, כגון SDS-PAGE ו- NMR.
וידאו זה מציג את המושגים של תיוג מטבולי ומציג שני הליכים כלליים. הראשון משתמש תיוג איזוטופי, כדי לאפיין את הזרחן של חלבון. השני מכסה תיוג פוטו-אקטיבי כדי לאפיין אינטראקציה בין חלבון חלבון בתוך שלושה יישומים של תיוג מטבולי מוצגים גם: תיוג חומר צמחי, תיוג RNA למדידת קינטיקה ותיוג גליקנים בפיתוח עוברים.
תיוג מטבולי משמש כדי לחקור את המכונות של תא. זה נעשה באמצעות אנלוגים כימיים כדי לחקור את התמורות הביוכימיות ושינויים המתרחשים. וידאו זה יציג את העקרונות של תיוג מטבולי, הליכי תיוג איזוטופיים ופוטורהאקטיביים טיפוסיים, וכמה יישומים.
תיוג מטבולי יכול להתבצע באמצעות מספר אסטרטגיות. כאן נתאר תיוג איזוטופי, פוטו-אקטיבי וביו-אורתוגונלי.
תיוג איזוטופי מבוצע באמצעות אנלוגים מבניים זהים מבחינה כימית למקביליהם הטבעיים, אך יש להם איזוטופים נדירים המשולבים במבנה שלהם. באנלוגי L-ליסין זה אטומי הפחמן והחנקן מוחלפים בפחמן-13 וחנקן-15. תאים בתרבית בנוכחות אנלוגים איזוטופיים ישלבו אותם במבנים הביוכימיים שלהם. מטבוליטים נאספים מהתאים ומטוהרים לניתוח. דגימות עם איזוטופים יציבים מנותחות באמצעות טכניקות כגון ספקטרומטריית מסה או ספקטרוסקופיית NMR. דגימות עם תוויות רדיואקטיביות מנותחות באמצעות ספירת נוצצים נוזלי וסרטי רנטגן, אשר יתדגמו בפרוטוקול התיוג האיזוטופי.
תוויות פוטו-אקטיביות הן קבוצות פונקציונליות המשולבות בחלבונים, יציבים עד שהם נחשפים לאור אולטרה סגול. הקבוצה התפקודית יוצרת רדיקל תגובתי, הנקשר לחלבון הקרוב ביותר. דוגמה נפוצה, L-photo-לאוצין, מכילה טבעת דיאזרין, שהיא חוצה פוטו-ריאקטיבית. בניגוד לתיוג איזוטופי, יש שונות כימית מסוימת בין אנלוגים כימיים פוטו-תגובתיים לבין עמיתיהם הטבעיים. תאים עשויים לשלב באופן מועדף תרכובות טבעיות על פני אנלוגים. לכן, חשוב לבצע תיוג צילום תגובתי בינוני ללא תרכובת להיות מיליה. לאחר שנחשפו לקרינה אולטרה סגולה, הקבוצות התפעוליות בחלבון המסומן הופכות לבלתי יציבות ומגיבות מאוד, מה שגורם לו להצליב קשר עם חלבונים אינטראקציה, ויוצר קומפלקס חלבונים. מתחמים מקושרים, פעלו כתמונות שניתן לנתח בשיטות ספקטרומטריית SDS-PAGE ומסה. זה מספק תובנות על מה תגובות מתרחשות במסלול המטבולי על ידי זיהוי מינים תגובה וכיצד הם אינטראקציה על ידי קביעת אתרים מחייבים.
אסטרטגיות תיוג ביואורתוגונליות משתמשות באנלוגים עם קבוצות פונקציונליות קטנות שאין להן תגובתיות מועטה עד ללא תגובה עם ביומולקולים טבעיים. לדוגמה, אזידים הם קבוצות פונקציונליות קטנות, אשר התגובה שלה הוא אמר להיות אורתוגונלי לתגובות ביוכימיות. בקשירת סטאודינגר, קבוצת פוספין תוקפת את קבוצת האזידו. זה מניב מצב מעבר שמגיב תוך עינית עם אסתר סמוכה, וכתוצאה מכך ליגנד מכובס באמין. קבוצות פונקציונליות ביואורתוגניות המשולבות ביומולקולים ניתן קשר עם תגי זיהוי כגון קבוצות פונקציונליות פלורסנט, ותגי זיקה כגון אנטיגנים.
עכשיו, לאחר שנדונו כמה מושגים ואסטרטגיות לתיוג מטבולי, בואו נסתכל על התהליך במעבדה.
הצעד הראשון בניסוי תיוג מטבולי הוא לאסוף את החלבון של עניין. כדי לעשות זאת, תאים גדלים על צלחת, שיטת ביטוי משמש כדי לקדם סינתזה של החלבון הרצוי. בדוגמה זו, קינאז חוזר עשיר בלאוצין, או LRRK, באים לידי ביטוי. דיסודיום פוספט, המכיל זרחן רדיואקטיבי-32, משמש כאנלוגי. יש לנקוט באמצעים מתאימים כדי להגן מפני קרינה מייננת. זה כולל הקמת אזור עבודה, לבישת ציוד מגן מתאים ובדיקת זיהום רדיואקטיבי. לאחר שננקטו אמצעי בטיחות, המדיום המכיל את האנלוגיות האיזוטופיות מוכן. המדיום מהתרבות מוסר, מוחלף באחד המכיל את האנלוגים הכימיים האיזוטופיים ולאחר מכן דגירה. לאחר הדגירה, התאים הם lysed. הלסייט נאסף ומטוהר.
לאחר הטיהור, חלבונים נפתרים באמצעות SDS-PAGE ולאחר מכן מועברים לקרום PVDF. אוטורדיוגרפיה מבוצעת על ידי חשיפת הממברנה לסרט רנטגן ונמדדת באמצעות צלם זרחן. סופג מערבי משמש למדידת רמות חלבון יחסית בקרום PVDF. בדוגמה זו נמדדו רמות הזרחן של קינאז חוזרות עשירות בלאוצין המסונתזות בתאי 293T. האוטורדיוגרמה מראה כמה זרחן שולב בחלבון. סופג מערבי מרומם את רמות החלבונים של LRRK. תוכנת ניתוח תמונה משמשת להשגת נתונים כמותיים של רמות הזרחן של החלבונים.
בהליך הבא, תיוג פוטוראקטיבי מוצג. ראשית, התאים מוכנים ומתרבתים. האנלוגי הפוטו-אקטיבי נוסף לתאים בשלב אמצע יומן הרישום ודגורה. בהליך זה p-בנזוילפניללאנין משמש. דגימות נאספות על פני מרווחי זמן ומונחות על קרח. לאחר מכן הדגימות נחשפות לקבלת תמונות של המסלולים הביוכימיים לאורך זמן. החלבונים מעניינים מטוהרים ונפתרים באמצעות SDS-PAGE.
אסטרטגיית תיוג פוטו-אקטיבית שימשה לזיהוי תרכובות שמתקשרות עם חלבון העניין. אימונודיקציה עם סופג מערבי מראה רצועות חלבון המצביעות על חלבונים במשקל מולקולרי גבוה יותר נמצאים בדגימות המוקרן. אלה הם מקישור צולב עקב אינטראקציה חלבון חלבון המתרחשת במהלך הקרנת UV.
כעת, לאחר שבדקנו הליכי תיוג מטבוליים, בואו נבחן כמה מהדרכים שבהן נעשה שימוש בתהליך.
מושגי תיוג מטבוליים יכולים להיות מורחבים לאורגניזמים רב תאיים. צמחים גדלים בסביבה אטומה, עשירים באיזוטופים יציבים לחומר צמחי מתויג. פחמן דו חמצני המכיל פחמן-13 מתווסף למתחם, בעוד דשן עשיר חנקן-15 משמש. החומר הצמחי שנקטף כתוצאה מכך יכול לעזור לענות על שאלות על רכיבה על אופניים פחמן וחנקן מן המערכת האקולוגית.
תיוג מאפשר הפרדה של RNA מסונתז חדש מ- RNA ישן יותר. על ידי שינוי הריכוז הראשוני של אנלוגי, ניתן לקבוע את הקינטיקה של סינתזת RNA חדשה. התוצאות מראות כי הריכוז של 4-תיורידין משפיע על כמה RNA חדש מתומלל. בנוסף, ניתן לכמת ישירות את שיעורי ההתאגדות של התווית ב-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
באמצעות כימיה של קליק ביורטוגונל, ניתן לתייג גליקנים בעובר דג זברה. הביצים מוזרקות עם תרכובת תיוג שתוצאתה תוויות אלקין על הגליקנים. הגליקנים בזחלים נקשרים לתרכובת צבע בשלב הפיתוח הרצוי. לאחר מכן, הגליקנים בעוברים נצצו. ניתן לזהות גליקנים המיוצרים בנקודות זמן שונות על ידי תיוג באמצעות צבעים שונים בשלבים שונים של התפתחות העובר.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על תיוג מטבולי. וידאו זה תיאר את המושגים מאחורי תיוג מטבולי והאסטרטגיות שלהם, עבר על שני הליכים כלליים, וכיסה חלק מהשימושים בטכניקות.
תודה שצפיתם!
Procedure
תיוג מטבולי משמש כדי לחקור את התמורות הביוכימיות ושינויים המתרחשים בתא. זה מושג באמצעות אנלוגים כימיים המחקים את המבנה של biomolecules טבעי. תאים משתמשים באנלוגים בתהליכים הביוכימיים האנדוגניים שלהם, ומייצרים תרכובות המסומנות. התווית מאפשרת שילוב של תגי זיהוי זיקה, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם כדי לפרט מסלולים מטבוליים באמצעות טכניקות אנליטיות ביוכימיות אחרות, כגון SDS-PAGE ו- NMR.
וידאו זה מציג את המושגים של תיוג מטבולי ומציג שני הליכים כלליים. הראשון משתמש תיוג איזוטופי, כדי לאפיין את הזרחן של חלבון. השני מכסה תיוג פוטו-אקטיבי כדי לאפיין אינטראקציה בין חלבון חלבון בתוך שלושה יישומים של תיוג מטבולי מוצגים גם: תיוג חומר צמחי, תיוג RNA למדידת קינטיקה ותיוג גליקנים בפיתוח עוברים.
תיוג מטבולי משמש כדי לחקור את המכונות של תא. זה נעשה באמצעות אנלוגים כימיים כדי לחקור את התמורות הביוכימיות ושינויים המתרחשים. וידאו זה יציג את העקרונות של תיוג מטבולי, הליכי תיוג איזוטופיים ופוטורהאקטיביים טיפוסיים, וכמה יישומים.
תיוג מטבולי יכול להתבצע באמצעות מספר אסטרטגיות. כאן נתאר תיוג איזוטופי, פוטו-אקטיבי וביו-אורתוגונלי.
תיוג איזוטופי מבוצע באמצעות אנלוגים מבניים זהים מבחינה כימית למקביליהם הטבעיים, אך יש להם איזוטופים נדירים המשולבים במבנה שלהם. באנלוגי L-ליסין זה אטומי הפחמן והחנקן מוחלפים בפחמן-13 וחנקן-15. תאים בתרבית בנוכחות אנלוגים איזוטופיים ישלבו אותם במבנים הביוכימיים שלהם. מטבוליטים נאספים מהתאים ומטוהרים לניתוח. דגימות עם איזוטופים יציבים מנותחות באמצעות טכניקות כגון ספקטרומטריית מסה או ספקטרוסקופיית NMR. דגימות עם תוויות רדיואקטיביות מנותחות באמצעות ספירת נוצצים נוזלי וסרטי רנטגן, אשר יתדגמו בפרוטוקול התיוג האיזוטופי.
תוויות פוטו-אקטיביות הן קבוצות פונקציונליות המשולבות בחלבונים, יציבים עד שהם נחשפים לאור אולטרה סגול. הקבוצה התפקודית יוצרת רדיקל תגובתי, הנקשר לחלבון הקרוב ביותר. דוגמה נפוצה, L-photo-לאוצין, מכילה טבעת דיאזרין, שהיא חוצה פוטו-ריאקטיבית. בניגוד לתיוג איזוטופי, יש שונות כימית מסוימת בין אנלוגים כימיים פוטו-תגובתיים לבין עמיתיהם הטבעיים. תאים עשויים לשלב באופן מועדף תרכובות טבעיות על פני אנלוגים. לכן, חשוב לבצע תיוג צילום תגובתי בינוני ללא תרכובת להיות מיליה. לאחר שנחשפו לקרינה אולטרה סגולה, הקבוצות התפעוליות בחלבון המסומן הופכות לבלתי יציבות ומגיבות מאוד, מה שגורם לו להצליב קשר עם חלבונים אינטראקציה, ויוצר קומפלקס חלבונים. מתחמים מקושרים, פעלו כתמונות שניתן לנתח בשיטות ספקטרומטריית SDS-PAGE ומסה. זה מספק תובנות על מה תגובות מתרחשות במסלול המטבולי על ידי זיהוי מינים תגובה וכיצד הם אינטראקציה על ידי קביעת אתרים מחייבים.
אסטרטגיות תיוג ביואורתוגונליות משתמשות באנלוגים עם קבוצות פונקציונליות קטנות שאין להן תגובתיות מועטה עד ללא תגובה עם ביומולקולים טבעיים. לדוגמה, אזידים הם קבוצות פונקציונליות קטנות, אשר התגובה שלה הוא אמר להיות אורתוגונלי לתגובות ביוכימיות. בקשירת סטאודינגר, קבוצת פוספין תוקפת את קבוצת האזידו. זה מניב מצב מעבר שמגיב תוך עינית עם אסתר סמוכה, וכתוצאה מכך ליגנד מכובס באמין. קבוצות פונקציונליות ביואורתוגניות המשולבות ביומולקולים ניתן קשר עם תגי זיהוי כגון קבוצות פונקציונליות פלורסנט, ותגי זיקה כגון אנטיגנים.
עכשיו, לאחר שנדונו כמה מושגים ואסטרטגיות לתיוג מטבולי, בואו נסתכל על התהליך במעבדה.
הצעד הראשון בניסוי תיוג מטבולי הוא לאסוף את החלבון של עניין. כדי לעשות זאת, תאים גדלים על צלחת, שיטת ביטוי משמש כדי לקדם סינתזה של החלבון הרצוי. בדוגמה זו, קינאז חוזר עשיר בלאוצין, או LRRK, באים לידי ביטוי. דיסודיום פוספט, המכיל זרחן רדיואקטיבי-32, משמש כאנלוגי. יש לנקוט באמצעים מתאימים כדי להגן מפני קרינה מייננת. זה כולל הקמת אזור עבודה, לבישת ציוד מגן מתאים ובדיקת זיהום רדיואקטיבי. לאחר שננקטו אמצעי בטיחות, המדיום המכיל את האנלוגיות האיזוטופיות מוכן. המדיום מהתרבות מוסר, מוחלף באחד המכיל את האנלוגים הכימיים האיזוטופיים ולאחר מכן דגירה. לאחר הדגירה, התאים הם lysed. הלסייט נאסף ומטוהר.
לאחר הטיהור, חלבונים נפתרים באמצעות SDS-PAGE ולאחר מכן מועברים לקרום PVDF. אוטורדיוגרפיה מבוצעת על ידי חשיפת הממברנה לסרט רנטגן ונמדדת באמצעות צלם זרחן. סופג מערבי משמש למדידת רמות חלבון יחסית בקרום PVDF. בדוגמה זו נמדדו רמות הזרחן של קינאז חוזרות עשירות בלאוצין המסונתזות בתאי 293T. האוטורדיוגרמה מראה כמה זרחן שולב בחלבון. סופג מערבי מרומם את רמות החלבונים של LRRK. תוכנת ניתוח תמונה משמשת להשגת נתונים כמותיים של רמות הזרחן של החלבונים.
בהליך הבא, תיוג פוטוראקטיבי מוצג. ראשית, התאים מוכנים ומתרבתים. האנלוגי הפוטו-אקטיבי נוסף לתאים בשלב אמצע יומן הרישום ודגורה. בהליך זה p-בנזוילפניללאנין משמש. דגימות נאספות על פני מרווחי זמן ומונחות על קרח. לאחר מכן הדגימות נחשפות לקבלת תמונות של המסלולים הביוכימיים לאורך זמן. החלבונים מעניינים מטוהרים ונפתרים באמצעות SDS-PAGE.
אסטרטגיית תיוג פוטו-אקטיבית שימשה לזיהוי תרכובות שמתקשרות עם חלבון העניין. אימונודיקציה עם סופג מערבי מראה רצועות חלבון המצביעות על חלבונים במשקל מולקולרי גבוה יותר נמצאים בדגימות המוקרן. אלה הם מקישור צולב עקב אינטראקציה חלבון חלבון המתרחשת במהלך הקרנת UV.
כעת, לאחר שבדקנו הליכי תיוג מטבוליים, בואו נבחן כמה מהדרכים שבהן נעשה שימוש בתהליך.
מושגי תיוג מטבוליים יכולים להיות מורחבים לאורגניזמים רב תאיים. צמחים גדלים בסביבה אטומה, עשירים באיזוטופים יציבים לחומר צמחי מתויג. פחמן דו חמצני המכיל פחמן-13 מתווסף למתחם, בעוד דשן עשיר חנקן-15 משמש. החומר הצמחי שנקטף כתוצאה מכך יכול לעזור לענות על שאלות על רכיבה על אופניים פחמן וחנקן מן המערכת האקולוגית.
תיוג מאפשר הפרדה של RNA מסונתז חדש מ- RNA ישן יותר. על ידי שינוי הריכוז הראשוני של אנלוגי, ניתן לקבוע את הקינטיקה של סינתזת RNA חדשה. התוצאות מראות כי הריכוז של 4-תיורידין משפיע על כמה RNA חדש מתומלל. בנוסף, ניתן לכמת ישירות את שיעורי ההתאגדות של התווית ב-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר.
באמצעות כימיה של קליק ביורטוגונל, ניתן לתייג גליקנים בעובר דג זברה. הביצים מוזרקות עם תרכובת תיוג שתוצאתה תוויות אלקין על הגליקנים. הגליקנים בזחלים נקשרים לתרכובת צבע בשלב הפיתוח הרצוי. לאחר מכן, הגליקנים בעוברים נצצו. ניתן לזהות גליקנים המיוצרים בנקודות זמן שונות על ידי תיוג באמצעות צבעים שונים בשלבים שונים של התפתחות העובר.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על תיוג מטבולי. וידאו זה תיאר את המושגים מאחורי תיוג מטבולי והאסטרטגיות שלהם, עבר על שני הליכים כלליים, וכיסה חלק מהשימושים בטכניקות.
תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
