Overview
L'etichettatura metabolica viene utilizzata per sondare le trasformazioni e le modifiche biochimiche che si verificano in una cellula. Ciò si ottiene utilizzando analoghi chimici che imitano la struttura delle biomolecole naturali. Le cellule utilizzano analoghi nei loro processi biochimici endogeni, producendo composti che sono etichettati. L'etichetta consente l'incorporazione di tag di rilevamento e affinità, che possono quindi essere utilizzati per chiarire le vie metaboliche utilizzando altre tecniche analitiche biochimiche, come SDS-PAGE e NMR.
Questo video introduce i concetti di etichettatura metabolica e mostra due procedure generali. Il primo utilizza l'etichettatura isotopica, per caratterizzare la fosforilazione di una proteina. Il secondo copre un'etichettatura fotoreattiva per caratterizzare l'interazione proteina-proteina all'interno di un Vengono presentate anche tre applicazioni di etichettatura metabolica: etichettatura del materiale vegetale, etichettatura dell'RNA per misurare la cinetica ed etichettatura dei glicani negli embrioni in via di sviluppo.
L'etichettatura metabolica viene utilizzata per studiare il meccanismo di una cellula. Ciò si ottiene utilizzando analoghi chimici per sondare le trasformazioni e le modifiche biochimiche che si verificano. Questo video mostrerà i principi dell'etichettatura metabolica, le tipiche procedure di etichettatura isotopica e fotoreattiva e alcune applicazioni.
L'etichettatura metabolica può essere condotta utilizzando una serie di strategie. Qui descriveremo l'etichettatura isotopica, fotoreattiva e bio-ortogonale.
L'etichettatura isotopica viene eseguita utilizzando analoghi strutturali che sono chimicamente identici alle loro controparti naturali, ma hanno isotopi non comuni incorporati nella loro struttura. In questo analogo della L-lisina gli atomi di carbonio e azoto sono sostituiti con carbonio-13 e azoto-15. Le cellule coltivate in presenza di analoghi isotopici li incorporeranno nelle loro strutture biochimiche. I metaboliti vengono raccolti dalle cellule e purificati per l'analisi. I campioni con isotopi stabili vengono analizzati utilizzando tecniche come la spettrometria di massa o la spettroscopia NMR. I campioni con etichette radioattive vengono analizzati utilizzando il conteggio a scintillazione liquida e le pellicole a raggi X, che saranno dimostrate nel protocollo di etichettatura isotopica.
Le etichette fotoreattive sono gruppi funzionali incorporati nelle proteine, che sono stabili fino a quando non vengono esposte alla luce ultravioletta. Il gruppo funzionale forma un radicale reattivo, che si lega alla proteina più vicina. Un esempio comune, L-foto-leucina, contiene un anello di diazirina, che è un reticolante fotoreattivo. In contrasto con l'etichettatura isotopica, c'è una certa dissomiglianza chimica tra gli analoghi chimici foto-reattivi e le loro controparti naturali. Le cellule possono preferenzialmente incorporare composti naturali rispetto ad analoghi. Pertanto, è importante eseguire l'etichettatura foto-reattiva in un mezzo privo del composto imitato. Una volta esposti alle radiazioni ultraviolette, i gruppi foto-reattivi in una proteina etichettata diventano instabili e altamente reattivi, facendola cross-linkare con le proteine interagenti, creando un complesso proteico. I complessi reticolati fungono da istantanee che possono quindi essere analizzate utilizzando i metodi SDS-PAGE e spettrometria di massa. Ciò fornisce informazioni su quali reazioni si verificano nella via metabolica identificando le specie di reazione e come interagiscono determinando i siti di legame.
Le strategie di etichettatura bioortogonale utilizzano analoghi con piccoli gruppi funzionali che hanno poca o nessuna reattività con le biomolecole naturali. Ad esempio, gli azidi sono piccoli gruppi funzionali, la cui reattività si dice ortogonale alle reazioni biochimiche. Nella legatura di Staudinger, un gruppo di fosfine attacca il gruppo azido. Ciò produce uno stato di transizione che reagisce intramolecolare con un estere vicino, risultando in un ligando legato all'ammina. I gruppi funzionali bioortogonali incorporati nelle biomolecole possono essere legati con tag di rilevamento come gruppi funzionali fluorescenti e tag di affinità come antigeni.
Ora che sono stati discussi alcuni concetti e strategie per l'etichettatura metabolica, diamo un'occhiata al processo in laboratorio.
Il primo passo in un esperimento di etichettatura metabolica è quello di raccogliere la proteina di interesse. Per fare questo, le cellule vengono coltivate su un piatto e viene utilizzato un metodo di espressione per promuovere la sintesi della proteina desiderata. In questo esempio, vengono espresse chinasi ripetute ricche di leucina, o LRRK. Il fosfato disodico, contenente fosforo-32 radioattivo, è usato come analogo. Devono essere prese misure adeguate per proteggersi dalle radiazioni ionizzanti. Ciò include la creazione di un'area di lavoro, l'uso di adeguati dispositivi di protezione e il controllo della contaminazione radioattiva. Una volta adottate le misure di sicurezza, viene preparato il mezzo contenente gli analoghi isotopici. Il mezzo dalla coltura viene rimosso e sostituito con uno contenente gli analoghi chimici isotopici e quindi incubato. Dopo l'incubazione, le cellule vengono lizzate. Il lisirato viene raccolto e purificato.
Dopo la purificazione, le proteine vengono risolte utilizzando SDS-PAGE e quindi trasferite su una membrana PVDF. L'autoradiografia viene eseguita esponendo la membrana alla pellicola a raggi X e misurata utilizzando un imager al fosforo. Il western blotting viene utilizzato per misurare i livelli relativi di proteine nella membrana PVDF. In questo esempio sono stati misurati i livelli di fosforilazione delle chinasi ripetute ricche di leucina sintetizzate in cellule 293T. L'autoradiogramma mostra quanto fosforo è stato incorporato nella proteina. Western blotting chiarisce i livelli delle proteine LRRK. Il software di analisi delle immagini viene utilizzato per ottenere dati quantitativi dei livelli di fosforilazione delle proteine.
In questa procedura successiva, viene dimostrata l'etichettatura fotoreattiva. In primo luogo, le cellule vengono preparate e coltivate. L'analogo fotoreattivo viene aggiunto alle cellule nella fase mid-log e incubato. In questa procedura viene utilizzata la p-benzoilfenilalanina. I campioni vengono raccolti a intervalli e messi su ghiaccio. I campioni vengono quindi esposti per ottenere istantanee dei percorsi biochimici nel tempo. Le proteine di interesse vengono poi purificate e risolte utilizzando SDS-PAGE.
Una strategia di etichettatura fotoreattiva è stata utilizzata per identificare i composti che interagiscono con la proteina di interesse. L'immunodetezione con Western blotting mostra bande proteiche che indicano che nei campioni irradiati sono presenti proteine a più alto peso molecolare. Questi sono da cross-linking a causa dell'interazione proteina-proteina che si verifica durante l'irradiazione UV.
Ora che abbiamo esaminato le procedure di etichettatura metabolica, diamo un'occhiata ad alcuni dei modi in cui viene utilizzato il processo.
I concetti di etichettatura metabolica possono essere estesi agli organismi multicellulari. Le piante vengono coltivate in un ambiente sigillato, ricco di isotopi stabili per produrre materiale vegetale etichettato. L'anidride carbonica contenente carbonio-13 viene aggiunta all'involucro, mentre viene utilizzato fertilizzante ricco di azoto-15. Il materiale vegetale raccolto risultante può aiutare a rispondere alle domande sul ciclo del carbonio e dell'azoto dall'ecosistema.
L'etichettatura consente la separazione dell'RNA appena sintetizzato dall'RNA più vecchio. Modificando la concentrazione iniziale di analogo, è possibile determinare la cinetica della sintesi di nuovo RNA. I risultati mostrano che la concentrazione di 4-tiouridina influisce sulla quantità di nuovo RNA trascritto. Inoltre, i tassi di incorporazione dell'etichetta nell'RNA possono essere quantificati direttamente con uno spettrofotometro.
Utilizzando la chimica dei clic biortogonali, i glicani in un embrione di pesce zebra possono essere etichettati. Le uova vengono iniettate con un composto di etichettatura che si traduce in etichette alchine sui glicani. I glicani nelle larve vengono quindi ligati a un composto colorante nella fase di sviluppo desiderata. I glicani negli embrioni vengono quindi ripresi. I glicani prodotti in diversi punti temporali possono essere identificati etichettando utilizzando colori diversi in diverse fasi dello sviluppo dell'embrione.
Hai appena visto il video di JoVE sull'etichettatura metabolica. Questo video ha descritto i concetti alla base dell'etichettatura metabolica e le loro strategie, ha esaminato due procedure generali e ha coperto alcuni degli usi delle tecniche.
Grazie per l'attenzione!
Procedure
L'etichettatura metabolica viene utilizzata per sondare le trasformazioni e le modifiche biochimiche che si verificano in una cellula. Ciò si ottiene utilizzando analoghi chimici che imitano la struttura delle biomolecole naturali. Le cellule utilizzano analoghi nei loro processi biochimici endogeni, producendo composti che sono etichettati. L'etichetta consente l'incorporazione di tag di rilevamento e affinità, che possono quindi essere utilizzati per chiarire le vie metaboliche utilizzando altre tecniche analitiche biochimiche, come SDS-PAGE e NMR.
Questo video introduce i concetti di etichettatura metabolica e mostra due procedure generali. Il primo utilizza l'etichettatura isotopica, per caratterizzare la fosforilazione di una proteina. Il secondo copre un'etichettatura fotoreattiva per caratterizzare l'interazione proteina-proteina all'interno di un Vengono presentate anche tre applicazioni di etichettatura metabolica: etichettatura del materiale vegetale, etichettatura dell'RNA per misurare la cinetica ed etichettatura dei glicani negli embrioni in via di sviluppo.
L'etichettatura metabolica viene utilizzata per studiare il meccanismo di una cellula. Ciò si ottiene utilizzando analoghi chimici per sondare le trasformazioni e le modifiche biochimiche che si verificano. Questo video mostrerà i principi dell'etichettatura metabolica, le tipiche procedure di etichettatura isotopica e fotoreattiva e alcune applicazioni.
L'etichettatura metabolica può essere condotta utilizzando una serie di strategie. Qui descriveremo l'etichettatura isotopica, fotoreattiva e bio-ortogonale.
L'etichettatura isotopica viene eseguita utilizzando analoghi strutturali che sono chimicamente identici alle loro controparti naturali, ma hanno isotopi non comuni incorporati nella loro struttura. In questo analogo della L-lisina gli atomi di carbonio e azoto sono sostituiti con carbonio-13 e azoto-15. Le cellule coltivate in presenza di analoghi isotopici li incorporeranno nelle loro strutture biochimiche. I metaboliti vengono raccolti dalle cellule e purificati per l'analisi. I campioni con isotopi stabili vengono analizzati utilizzando tecniche come la spettrometria di massa o la spettroscopia NMR. I campioni con etichette radioattive vengono analizzati utilizzando il conteggio a scintillazione liquida e le pellicole a raggi X, che saranno dimostrate nel protocollo di etichettatura isotopica.
Le etichette fotoreattive sono gruppi funzionali incorporati nelle proteine, che sono stabili fino a quando non vengono esposte alla luce ultravioletta. Il gruppo funzionale forma un radicale reattivo, che si lega alla proteina più vicina. Un esempio comune, L-foto-leucina, contiene un anello di diazirina, che è un reticolante fotoreattivo. In contrasto con l'etichettatura isotopica, c'è una certa dissomiglianza chimica tra gli analoghi chimici foto-reattivi e le loro controparti naturali. Le cellule possono preferenzialmente incorporare composti naturali rispetto ad analoghi. Pertanto, è importante eseguire l'etichettatura foto-reattiva in un mezzo privo del composto imitato. Una volta esposti alle radiazioni ultraviolette, i gruppi foto-reattivi in una proteina etichettata diventano instabili e altamente reattivi, facendola cross-linkare con le proteine interagenti, creando un complesso proteico. I complessi reticolati fungono da istantanee che possono quindi essere analizzate utilizzando i metodi SDS-PAGE e spettrometria di massa. Ciò fornisce informazioni su quali reazioni si verificano nella via metabolica identificando le specie di reazione e come interagiscono determinando i siti di legame.
Le strategie di etichettatura bioortogonale utilizzano analoghi con piccoli gruppi funzionali che hanno poca o nessuna reattività con le biomolecole naturali. Ad esempio, gli azidi sono piccoli gruppi funzionali, la cui reattività si dice ortogonale alle reazioni biochimiche. Nella legatura di Staudinger, un gruppo di fosfine attacca il gruppo azido. Ciò produce uno stato di transizione che reagisce intramolecolare con un estere vicino, risultando in un ligando legato all'ammina. I gruppi funzionali bioortogonali incorporati nelle biomolecole possono essere legati con tag di rilevamento come gruppi funzionali fluorescenti e tag di affinità come antigeni.
Ora che sono stati discussi alcuni concetti e strategie per l'etichettatura metabolica, diamo un'occhiata al processo in laboratorio.
Il primo passo in un esperimento di etichettatura metabolica è quello di raccogliere la proteina di interesse. Per fare questo, le cellule vengono coltivate su un piatto e viene utilizzato un metodo di espressione per promuovere la sintesi della proteina desiderata. In questo esempio, vengono espresse chinasi ripetute ricche di leucina, o LRRK. Il fosfato disodico, contenente fosforo-32 radioattivo, è usato come analogo. Devono essere prese misure adeguate per proteggersi dalle radiazioni ionizzanti. Ciò include la creazione di un'area di lavoro, l'uso di adeguati dispositivi di protezione e il controllo della contaminazione radioattiva. Una volta adottate le misure di sicurezza, viene preparato il mezzo contenente gli analoghi isotopici. Il mezzo dalla coltura viene rimosso e sostituito con uno contenente gli analoghi chimici isotopici e quindi incubato. Dopo l'incubazione, le cellule vengono lizzate. Il lisirato viene raccolto e purificato.
Dopo la purificazione, le proteine vengono risolte utilizzando SDS-PAGE e quindi trasferite su una membrana PVDF. L'autoradiografia viene eseguita esponendo la membrana alla pellicola a raggi X e misurata utilizzando un imager al fosforo. Il western blotting viene utilizzato per misurare i livelli relativi di proteine nella membrana PVDF. In questo esempio sono stati misurati i livelli di fosforilazione delle chinasi ripetute ricche di leucina sintetizzate in cellule 293T. L'autoradiogramma mostra quanto fosforo è stato incorporato nella proteina. Western blotting chiarisce i livelli delle proteine LRRK. Il software di analisi delle immagini viene utilizzato per ottenere dati quantitativi dei livelli di fosforilazione delle proteine.
In questa procedura successiva, viene dimostrata l'etichettatura fotoreattiva. In primo luogo, le cellule vengono preparate e coltivate. L'analogo fotoreattivo viene aggiunto alle cellule nella fase mid-log e incubato. In questa procedura viene utilizzata la p-benzoilfenilalanina. I campioni vengono raccolti a intervalli e messi su ghiaccio. I campioni vengono quindi esposti per ottenere istantanee dei percorsi biochimici nel tempo. Le proteine di interesse vengono poi purificate e risolte utilizzando SDS-PAGE.
Una strategia di etichettatura fotoreattiva è stata utilizzata per identificare i composti che interagiscono con la proteina di interesse. L'immunodetezione con Western blotting mostra bande proteiche che indicano che nei campioni irradiati sono presenti proteine a più alto peso molecolare. Questi sono da cross-linking a causa dell'interazione proteina-proteina che si verifica durante l'irradiazione UV.
Ora che abbiamo esaminato le procedure di etichettatura metabolica, diamo un'occhiata ad alcuni dei modi in cui viene utilizzato il processo.
I concetti di etichettatura metabolica possono essere estesi agli organismi multicellulari. Le piante vengono coltivate in un ambiente sigillato, ricco di isotopi stabili per produrre materiale vegetale etichettato. L'anidride carbonica contenente carbonio-13 viene aggiunta all'involucro, mentre viene utilizzato fertilizzante ricco di azoto-15. Il materiale vegetale raccolto risultante può aiutare a rispondere alle domande sul ciclo del carbonio e dell'azoto dall'ecosistema.
L'etichettatura consente la separazione dell'RNA appena sintetizzato dall'RNA più vecchio. Modificando la concentrazione iniziale di analogo, è possibile determinare la cinetica della sintesi di nuovo RNA. I risultati mostrano che la concentrazione di 4-tiouridina influisce sulla quantità di nuovo RNA trascritto. Inoltre, i tassi di incorporazione dell'etichetta nell'RNA possono essere quantificati direttamente con uno spettrofotometro.
Utilizzando la chimica dei clic biortogonali, i glicani in un embrione di pesce zebra possono essere etichettati. Le uova vengono iniettate con un composto di etichettatura che si traduce in etichette alchine sui glicani. I glicani nelle larve vengono quindi ligati a un composto colorante nella fase di sviluppo desiderata. I glicani negli embrioni vengono quindi ripresi. I glicani prodotti in diversi punti temporali possono essere identificati etichettando utilizzando colori diversi in diverse fasi dello sviluppo dell'embrione.
Hai appena visto il video di JoVE sull'etichettatura metabolica. Questo video ha descritto i concetti alla base dell'etichettatura metabolica e le loro strategie, ha esaminato due procedure generali e ha coperto alcuni degli usi delle tecniche.
Grazie per l'attenzione!
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
