단백질 결정화

단백질 결정화는 단백질의 격자 고체 형태를 얻는 과정입니다. 이 결정은 단백질 기능의 연구 결과에 도움을 주며 구조 생물학자들에게 특히 중요합니다. 질량 사양 또는 SDS-PAGE와 같은 다른 기술은 단백질의 1차원 구조에 대한 정보만 제공할 수 있습니다. 단백질 결정화는 재조합 단백질 발현 및 엑스레이 회절의 기술에 의해 보완됩니다. 이 비디오는 단백질 결정화의 원리, 일반적인 실험실 절차 및 생화학 분야에서의 몇 가지 응용 분야를 보여줍니다.

공정에서 요구되는 첫 번째 단계는 일반적으로 재조합 단백질 발현을 사용하여 매우 순수한 단백질의 밀리그램 양을 얻는 것입니다. 관심 있는 단백질에 대응하는 유전자는 발현 벡터로 복제되고, 발현 단백질은 폴리 히스티딘과 같은 친화성 태그에 융합되어 친화성 크로마토그래피에 의한 정화를 지원한다. 자세한 내용은 친화도 크로마토그래피에 대한 이 컬렉션의 비디오를 참조하십시오.

정제된 단백질을 결정으로 형성하는 것은 pH, 이온 강도, 침전제 및 단백질의 농도, 온도 및 평형 속도를 포함한 많은 요인의 적절한 조합에 달려 있습니다. 사용되는 가장 일반적인 방법은 증기 확산이며, 그 중 두 가지 범주가 있습니다: 매달려 드롭과 앉는 방울. 순수 단백질, 완충제 및 침전제를 함유하는 액적물은 물 분자를 결합하여 단백질의 물 가용성을 줄이고 더 높은 단백질 농도를 모방하는 이온 고체이며, 동일한 완충제와 침전제의 고농축 혼합물을 가진 저수지가 있는 밀폐된 마이크로웰에 있습니다. 처음에, 단백질과 침전제의 농도는 결정화를 일으키는 원인이 되기 위하여 너무 낮습니다. 실험 과정에서 물방울에서 수화하여 저수지에서 수거합니다. 물방울의 물의 양이 감소하면 시스템이 과포화되고 핵화가 발생하여 결정화가 발생할 수 있습니다. 물방울에서 물의 순 전송은 평형에 있으며 프로세스가 완료 될 때까지 시스템이 유지됩니다.

3D 구조를 시각화하려면 X-ray 회절이 사용됩니다. 결정으로부터 엑스레이 데이터를 얻으려면 단색 엑스레이 빔에 배치되어 모든 각도에서 빔에 노출됩니다. 각 노출은 각 스팟이 결정에서 나오고 검출기에 의해 등록된 분산된 엑스레이인 이미지를 제공합니다. 데이터는 결합되어 크리스탈 내에서 원자의 배열 모델을 생성합니다. 결과 결정 구조는 원자의 3 차원 배치를 보여 주며, 2 개의 앙스트롬의 전형적인 해상도를 보여줍니다.

이제 우리는 단백질 결정화의 원리를 다루었으니, 일반화된 프로토콜을 살펴보겠습니다.

시술을 시작하려면 관심 있는 유전자를 포함하는 발현 벡터가 세포로 변환된다. 세포는 배양되고 중간 로그 단계에서, 발현은 유전자의 mRNA의 전사를 시작하는 IPTG와 같은 유도자를 추가하여 시작됩니다. 단백질 발현 후, 원유 물질은 리시스 완충제에서 중단된 다음 원심분리에 의해 명확히 된다.

정제된 lysate는 니켈 컬럼에 적재되고, 폴리히스티딘 태그단백질은 다른 모든 생체분자를 씻어내면서 컬럼에 결합한다.

순수한 단백질의 여러 밀리그램이 얻어지면 증기 확산에 의한 결정화준비가 되어 있습니다. 24웰의 매달려/앉는 드롭 트레이는 염화 나트륨과 아세테이트 나트륨 완충액의 다양한 농도로 채워집니다. 착석 방법의 경우 동일한 양의 단백질과 저수지 용액이 각 우물 위의 선반에 파이프를 넣고 트레이는 투명 테이프로 덮여 있습니다. 트레이는 다음 날, 다음 날, 다음 날에 성장을 위해 모니터링되는 인큐베이션 챔버에 배치됩니다.

적절한 결정이 얻어지면 X 선 회절 분석을 위한 준비가 되었습니다. 결정은 선택된 방향으로 결정을 배치하기 위해 고니오미터에 장착됩니다. 크리스탈은 모든 각도에서 X 선의 단색 빔으로 조명되어 회절 패턴을 생성합니다. 이 소프트웨어는 다른 방향으로 촬영한 2차원 이미지를 결정에서 원자의 위치를 결정함으로써 결정 내의 전자 밀도의 3차원 모델로 변환합니다.

이제 절차를 검토한 결과, 단백질 결정화의 유용한 응용 분야와 또 다른 결정화 기법을 검토해 보겠습니다.

단백질 결정화는 실리코 약물 설계에 사용될 수 있다. 포유류의 바이러스 감염과 관련이 있는 인플루엔자 바이러스의 폴리머라제 기본 단백질 2의 3차원 구조는 결정화 및 엑스레이 회절에 의해 결정화되었다. 단백질에 있는 잠재적인 결합 사이트는 시각화되고, 도킹 프로그램의 사용으로, 3차원 분자는 단백질에 있는 갈라진으로 삽입할 것을 디자인되었습니다.

단백질-DNA 복합체의 코결정화도 유용한 기술이다. DNA 결합 단백질은 전사 및 DNA 중합 및 DNA 수리와 같은 다양한 생물학적 기능을 조절합니다. 이러한 복합체의 결정 구조는 단백질 기능, 메커니즘 및 특정 상호 작용의 특성에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 대장균 단백질 SeqA, DNA 복제의 부정적인 레귤레이터, hemimethylated DNA와 함께 결정화 되었다.

G-단백질 결합 수용체 또는 GCPRs와 같은 일체형 멤브레인 단백질은 결정 격자 접합을 형성하는 데 사용할 수 있는 제한된 양의 극지 표면적으로 인해 결정화하기 어렵고, 이는 융합 단백질 보조 단백질 결정화의 발달로 이어졌다. β2 아드레인기수용체, GCPR 및 리소자임을 인코딩하는 유전자는 발현 벡터로 삽입되었다. β2AR-리소자임 융합 단백질의 결정화는 리소지임에 의해 제공되는 자연소수성 β2AR을 통해 세포외 소수성 표면이 증가함에 따라 달성되었으며, 결정 격자에서 포장 상호 작용을 형성하는 데 필요한 것이다.

당신은 단백질 결정화에 JoVE의 비디오를 보았다. 이 비디오는 그 원리, 일반화 된 프로토콜 및 생물 의학 분야에서의 일부 용도를 설명했습니다. 시청해 주셔서 감사합니다!