Overview
Cristalização proteica, obtenção de uma rede sólida de biomoléculas, elucida estrutura proteica e permite o estudo da função proteica. A cristalização envolve a secagem da proteína purificada sob uma combinação de muitos fatores, incluindo pH, temperatura, força iônica e concentração de proteínas. Uma vez obtidos cristais, a estrutura proteica pode ser elucidada por difração de raios-X e computação de um modelo de densidade eletrônica.
Este vídeo introduz cristalização de proteínas e mostra um procedimento geral. A expressão e purificação da proteína, a cristalização e a difração de raios-X são abordadas no procedimento. As aplicações da cristalização proteica incluem no projeto de medicamentos de silico, determinação do local de ligação e análise da estrutura da proteína da membrana.
Cristalização proteica é o processo de obtenção de uma forma sólida latticed de uma proteína. Esses cristais são especialmente valiosos para biólogos estruturais, auxiliando no estudo da função proteica. Outras técnicas, como a especificação de massa ou ODS-PAGE, só podem fornecer informações sobre a estrutura unidimensional das proteínas. A cristalização proteica é complementada pelas técnicas de expressão proteica recombinante e difração de raios-X. Este vídeo mostrará os princípios da cristalização proteica, um procedimento laboratorial geral e várias de suas aplicações no campo bioquímico.
O primeiro passo necessário no processo é obter quantidades miligramas de proteína muito pura, tipicamente usando expressão de proteína recombinante. O gene correspondente à proteína de interesse é clonado em um vetor de expressão, e a proteína expressa é fundida a uma etiqueta de afinidade, como a poli-histidina, para auxiliar na purificação por cromatografia de afinidade. Para saber mais, veja o vídeo desta coleção sobre cromatografia de afinidade.
A formação da proteína purificada em cristais depende da combinação adequada de muitos fatores, incluindo pH, força iônica, concentrações de precipitantes e proteínas, temperatura e taxa de equilíbrio. O método mais comum utilizado é a difusão de vapor, das quais existem duas categorias: queda pendurada e queda sentada. Uma gotícula contendo proteína pura, tampão e precipitante, que é um sólido iônico que liga moléculas de água, reduzindo a disponibilidade de água para a proteína e imitando maior concentração de proteínas, está em um microwell fechado com um reservatório com uma mistura mais altamente concentrada do mesmo tampão e precipitante. No início, as concentrações de proteína e precipitante são muito baixas para causar cristalização. Durante o experimento, a água vaporiza a partir da gotícula e coleta no reservatório; uma diminuição na quantidade de água na gotícula faz com que o sistema fique supersaturado, e a nucleação, seguida de cristalização, pode ocorrer. A transferência líquida de água da gotícula está em equilíbrio, e o sistema é mantido até que o processo seja concluído.
Para visualizar a estrutura 3D, é utilizada a difração de raios-X. Para obter dados de raio-x de um cristal, ele é colocado em um feixe de raio-x monocromático, onde é exposto ao feixe em todos os ângulos. Cada exposição fornece uma imagem, onde cada ponto é um raio-x difundido, que emerge do cristal e é registrado por um detector. Os dados são combinados para produzir um modelo do arranjo de átomos dentro do cristal. A estrutura cristalina resultante demonstra a colocação tridimensional dos átomos, com uma resolução típica de 2 angstroms.
Agora que cobrimos os princípios da cristalização de proteínas, vamos olhar para um protocolo generalizado.
Para iniciar o procedimento, um vetor de expressão contendo o gene de interesse é transformado em células. As células são incubadas e na fase de registro médio, a expressão é iniciada adicionando um indutor, como o IPTG, que desencadeia a transcrição do mRNA do gene. Após a expressão proteica, o material bruto é suspenso em tampão de lise e, em seguida, esclarecido por centrifugação.
O lise esclarecido é então carregado em uma coluna de níquel, e a proteína marcada por polihistidina se liga à coluna enquanto todas as outras biomoléculas são lavadas.
Uma vez obtidos vários miligramas de proteína pura, ele está pronto para cristalização por difusão de vapor. Uma bandeja de gota suspensa/sentada de 24 poços é preenchida com concentrações variadas de soluções de cloreto de sódio e tampão de acetato de sódio. Para o método de queda sentada, volumes iguais de proteína e solução de reservatório são encatos na prateleira acima de cada poço, e então a bandeja é coberta com fita transparente. A bandeja é então colocada em uma câmara de incubação, e os poços são monitorados para crescimento no dia seguinte, então a cada poucos dias.
Uma vez obtido um cristal adequado, ele está pronto para análise de difração de raios-X. O cristal é montado em um goniômetro para posicionar o cristal em orientações selecionadas. O cristal é iluminado com um feixe monocromático de raios-X em todos os ângulos, produzindo um padrão de difração. O software converte as imagens bidimensionais, tiradas em diferentes orientações, em um modelo tridimensional da densidade de elétrons dentro do cristal, determinando as posições dos átomos no cristal.
Agora que revisamos um procedimento, vamos rever algumas aplicações úteis de cristalização de proteínas, e outra técnica de cristalização.
A cristalização proteica pode ser usada no projeto de medicamentos de sílico. A estrutura tridimensional da proteína básica de polimerase 2 do vírus influenza, que tem sido ligada à infecção viral em mamíferos, foi determinada pela cristalização e difração de raios-X. Potenciais locais de ligação na proteína são visualizados, e com o uso de um programa de acoplamento, uma molécula tridimensional foi projetada que se inseriria em uma fissura na proteína.
A co-cristalização de complexos de proteína-DNA também é uma técnica útil. Proteínas de ligação de DNA modulam uma grande variedade de funções biológicas, como transcrição e polimerização de DNA e reparação de DNA; e estruturas cristalinas desses complexos podem fornecer informações sobre a função proteica, o mecanismo e a natureza da interação específica. A proteína E. coli SeqA, um regulador negativo da replicação do DNA, foi co-cristalizada com DNA hemimimetilado.
Proteínas integrais de membrana, como receptores acoplados de proteína G, ou GCPRs, são difíceis de cristalizar devido à sua quantidade limitada de área de superfície polar disponível para a formação de contatos de rede cristalina, o que levou ao desenvolvimento da cristalização de proteína assistida por proteína de fusão. Genes codificando receptor β2 adrenérgico, um GCPR e uma lisozyme foram inseridos em um vetor de expressão. A cristalização da proteína de fusão β2AR-lysozyme foi alcançada devido ao aumento da superfície hidrofílica extracelular sobre o β2AR naturalmente hidrofóbico, fornecido pela lise, necessário para formar interações de embalagem na rede cristalina.
Você acabou de ver o vídeo do JoVE sobre cristalização de proteínas. Este vídeo descreveu seus princípios, um protocolo generalizado, e alguns de seus usos no campo biomédico. Obrigado por assistir!
Procedure
Cristalização proteica, obtenção de uma rede sólida de biomoléculas, elucida estrutura proteica e permite o estudo da função proteica. A cristalização envolve a secagem da proteína purificada sob uma combinação de muitos fatores, incluindo pH, temperatura, força iônica e concentração de proteínas. Uma vez obtidos cristais, a estrutura proteica pode ser elucidada por difração de raios-X e computação de um modelo de densidade eletrônica.
Este vídeo introduz cristalização de proteínas e mostra um procedimento geral. A expressão e purificação da proteína, a cristalização e a difração de raios-X são abordadas no procedimento. As aplicações da cristalização proteica incluem no projeto de medicamentos de silico, determinação do local de ligação e análise da estrutura da proteína da membrana.
Cristalização proteica é o processo de obtenção de uma forma sólida latticed de uma proteína. Esses cristais são especialmente valiosos para biólogos estruturais, auxiliando no estudo da função proteica. Outras técnicas, como a especificação de massa ou ODS-PAGE, só podem fornecer informações sobre a estrutura unidimensional das proteínas. A cristalização proteica é complementada pelas técnicas de expressão proteica recombinante e difração de raios-X. Este vídeo mostrará os princípios da cristalização proteica, um procedimento laboratorial geral e várias de suas aplicações no campo bioquímico.
O primeiro passo necessário no processo é obter quantidades miligramas de proteína muito pura, tipicamente usando expressão de proteína recombinante. O gene correspondente à proteína de interesse é clonado em um vetor de expressão, e a proteína expressa é fundida a uma etiqueta de afinidade, como a poli-histidina, para auxiliar na purificação por cromatografia de afinidade. Para saber mais, veja o vídeo desta coleção sobre cromatografia de afinidade.
A formação da proteína purificada em cristais depende da combinação adequada de muitos fatores, incluindo pH, força iônica, concentrações de precipitantes e proteínas, temperatura e taxa de equilíbrio. O método mais comum utilizado é a difusão de vapor, das quais existem duas categorias: queda pendurada e queda sentada. Uma gotícula contendo proteína pura, tampão e precipitante, que é um sólido iônico que liga moléculas de água, reduzindo a disponibilidade de água para a proteína e imitando maior concentração de proteínas, está em um microwell fechado com um reservatório com uma mistura mais altamente concentrada do mesmo tampão e precipitante. No início, as concentrações de proteína e precipitante são muito baixas para causar cristalização. Durante o experimento, a água vaporiza a partir da gotícula e coleta no reservatório; uma diminuição na quantidade de água na gotícula faz com que o sistema fique supersaturado, e a nucleação, seguida de cristalização, pode ocorrer. A transferência líquida de água da gotícula está em equilíbrio, e o sistema é mantido até que o processo seja concluído.
Para visualizar a estrutura 3D, é utilizada a difração de raios-X. Para obter dados de raio-x de um cristal, ele é colocado em um feixe de raio-x monocromático, onde é exposto ao feixe em todos os ângulos. Cada exposição fornece uma imagem, onde cada ponto é um raio-x difundido, que emerge do cristal e é registrado por um detector. Os dados são combinados para produzir um modelo do arranjo de átomos dentro do cristal. A estrutura cristalina resultante demonstra a colocação tridimensional dos átomos, com uma resolução típica de 2 angstroms.
Agora que cobrimos os princípios da cristalização de proteínas, vamos olhar para um protocolo generalizado.
Para iniciar o procedimento, um vetor de expressão contendo o gene de interesse é transformado em células. As células são incubadas e na fase de registro médio, a expressão é iniciada adicionando um indutor, como o IPTG, que desencadeia a transcrição do mRNA do gene. Após a expressão proteica, o material bruto é suspenso em tampão de lise e, em seguida, esclarecido por centrifugação.
O lise esclarecido é então carregado em uma coluna de níquel, e a proteína marcada por polihistidina se liga à coluna enquanto todas as outras biomoléculas são lavadas.
Uma vez obtidos vários miligramas de proteína pura, ele está pronto para cristalização por difusão de vapor. Uma bandeja de gota suspensa/sentada de 24 poços é preenchida com concentrações variadas de soluções de cloreto de sódio e tampão de acetato de sódio. Para o método de queda sentada, volumes iguais de proteína e solução de reservatório são encatos na prateleira acima de cada poço, e então a bandeja é coberta com fita transparente. A bandeja é então colocada em uma câmara de incubação, e os poços são monitorados para crescimento no dia seguinte, então a cada poucos dias.
Uma vez obtido um cristal adequado, ele está pronto para análise de difração de raios-X. O cristal é montado em um goniômetro para posicionar o cristal em orientações selecionadas. O cristal é iluminado com um feixe monocromático de raios-X em todos os ângulos, produzindo um padrão de difração. O software converte as imagens bidimensionais, tiradas em diferentes orientações, em um modelo tridimensional da densidade de elétrons dentro do cristal, determinando as posições dos átomos no cristal.
Agora que revisamos um procedimento, vamos rever algumas aplicações úteis de cristalização de proteínas, e outra técnica de cristalização.
A cristalização proteica pode ser usada no projeto de medicamentos de sílico. A estrutura tridimensional da proteína básica de polimerase 2 do vírus influenza, que tem sido ligada à infecção viral em mamíferos, foi determinada pela cristalização e difração de raios-X. Potenciais locais de ligação na proteína são visualizados, e com o uso de um programa de acoplamento, uma molécula tridimensional foi projetada que se inseriria em uma fissura na proteína.
A co-cristalização de complexos de proteína-DNA também é uma técnica útil. Proteínas de ligação de DNA modulam uma grande variedade de funções biológicas, como transcrição e polimerização de DNA e reparação de DNA; e estruturas cristalinas desses complexos podem fornecer informações sobre a função proteica, o mecanismo e a natureza da interação específica. A proteína E. coli SeqA, um regulador negativo da replicação do DNA, foi co-cristalizada com DNA hemimimetilado.
Proteínas integrais de membrana, como receptores acoplados de proteína G, ou GCPRs, são difíceis de cristalizar devido à sua quantidade limitada de área de superfície polar disponível para a formação de contatos de rede cristalina, o que levou ao desenvolvimento da cristalização de proteína assistida por proteína de fusão. Genes codificando receptor β2 adrenérgico, um GCPR e uma lisozyme foram inseridos em um vetor de expressão. A cristalização da proteína de fusão β2AR-lysozyme foi alcançada devido ao aumento da superfície hidrofílica extracelular sobre o β2AR naturalmente hidrofóbico, fornecido pela lise, necessário para formar interações de embalagem na rede cristalina.
Você acabou de ver o vídeo do JoVE sobre cristalização de proteínas. Este vídeo descreveu seus princípios, um protocolo generalizado, e alguns de seus usos no campo biomédico. Obrigado por assistir!
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Disclosures
Nenhum conflito de interesses declarado.
