Overview
Protein-Kristallisation, erhalten eine feste Gitter von Biomolekülen, erläutert Proteinstruktur und ermöglicht die Untersuchung von Proteinfunktion. Kristallisation ist das Trocknen von gereinigten Proteins unter einer Kombination von vielen Faktoren ab, einschließlich Proteinkonzentration, pH-Wert, Temperatur und Ionenstärke. Das gewonnene Kristalle sind kann die Proteinstruktur durch Röntgenbeugung und Berechnung eines Elektron-Dichte-Modells aufgeklärt werden.
Dieses Video stellt Protein Kristallisation und zeigt ein allgemeines Verfahren. Proteinexpression und Reinigung, Kristallisation und x-ray Diffraction fallen in das Verfahren. Anwendungsbereiche der Protein-Kristallisation in Silico Drug Design, verbindliche Website Entschlossenheit und Membran-Protein-Struktur-Analyse.
Protein-Kristallisation ist das Verfahren zur Erlangung eines vergitterten festen Form eines Proteins. Diese Kristalle sind besonders wertvoll für Strukturbiologen, Unterstützung in der Studie der Proteinfunktion. Andere Techniken wie mass Spec oder SDS-PAGE, können nur Informationen über die eindimensionale Struktur von Proteinen. Protein-Kristallisation wird ergänzt durch die Techniken der rekombinante Proteinexpression und Röntgenbeugung. Dieses Video zeigt die Grundsätze der Protein-Kristallisation, eine allgemeine Laborverfahren und einige ihrer Anwendungen im biochemischen Bereich.
Der erste Schritt in diesem Prozess erforderlich ist, Milligramm-Mengen von sehr reines Protein, in der Regel mit rekombinante Proteinexpression zu erhalten. Das Gen, das Protein des Interesses entsprechen ist in einen Ausdruck Vektor kloniert und exprimierten Protein ist, die Bezeichnung für einen Affinität, wie Poly-Histidin, um bei der Reinigung durch Affinitätschromatographie verschmolzen. Um mehr zu erfahren, sehen Sie diese Sammlung Video auf Affinitätschromatographie.
Bildung des gereinigten Proteins in Kristalle ist die richtige Kombination von vielen Faktoren ab, einschließlich pH-Wert, Ionenstärke, Konzentrationen von Fällungsmittel und Protein, Temperatur und Geschwindigkeit von Gleichgewichtherstellung abhängig. Die am häufigste verwendete Methode ist Dampf Diffusion, davon gibt es zwei Kategorien: hängende Drop- and -Drop sitzen. Ein Tropfen enthält reines Protein, Puffer und Fällungsmittel, die eine ionische ist solide, die Wassermoleküle, Verringerung der Verfügbarkeit von Wasser für das Protein bindet und imitiert höhere Proteinkonzentration ist in einem geschlossenen Microwell mit einem Reservoir mit einer höher konzentrierten Mischung aus dem gleichen Puffer und Fällungsmittel. Am Anfang sind die Konzentrationen von Eiweiß und Fällungsmittel zu niedrig, um die Kristallisation zu verursachen. Im Laufe des Experiments Wasser aus der Tropfen verdampft und sammelt sich im Behälter; ein Rückgang in Höhe von Wasser in das Droplet veranlasst das System übersättigt werden, und Keimbildung, gefolgt von Kristallisation, auftreten kann. Die Netto-Transfer von Wasser aus der Tropfen ist im Gleichgewicht, und das System wird beibehalten, bis der Vorgang abgeschlossen ist.
Um die 3D-Struktur zu visualisieren, ist x-ray Diffraction verwendet. Um Röntgendaten aus einem Kristall zu erhalten, wird es in einem monochromen Röntgenstrahl platziert ist der Strahl in allen Winkeln wo es. Jeder Belichtung liefert ein Bild, wo jeder einzelne Strahler einer gebeugten Röntgenstrahlen ist, ergibt sich aus dem Kristall und wird durch einen Detektor registriert. Die Daten werden kombiniert, um ein Modell der Anordnung der Atome im Inneren des Kristalls zu produzieren. Die daraus resultierende Kristallstruktur zeigt die 3-dimensionale Platzierung der Atome, mit einer typischen Auflösung von 2 Angström.
Nun, da wir die Grundsätze der Protein-Kristallisation besprochen haben, schauen Sie wir uns ein allgemeines Protokoll.
Um den Vorgang zu starten ist eine Expressionsvektor, enthält das gen des Interesses in Zellen umgewandelt. Die Zellen inkubiert und am Mid Log-Phase, wird Ausdruck durch Zugabe von einem Induktor z. B. IPTG, die Transkription des Gens mRNA löst initiiert. Nach Protein-Expression ist das rohe Material in Lyse Puffer suspendiert und dann durch Zentrifugation geklärt.
Die geklärte lysate wird dann auf eine Nickel-Spalte geladen, und das Polyhistidine-markierte Protein bindet an die Spalte während andere Biomoleküle weggespült werden.
Sobald mehrere Milligramm reines Protein erhalten haben, ist es bereit für die Kristallisation durch Dampf-Diffusion. Ein 24-Well hängenden/Sitzung Drop-Tablett ist gefüllt mit unterschiedlichen Konzentrationen von Natrium-Chlorid und Natrium-Acetat-Puffer-Lösungen. Für die Sitzung drop-Methode, gleiche Volumina von Protein und Reservoir Lösung sind auf dem Regal über jede Vertiefung pipettieren und dann das Fach mit durchsichtigen Klebeband bedeckt ist. Das Fach befindet sich dann in einer Inkubation Kammer, und die Brunnen sind für das Wachstum am folgenden Tag, dann alle paar Tage überwacht.
Sobald ein richtige Kristall erreicht wurde ist bereit für Röntgenbeugungsanalyse. Der Kristall ist auf ein Goniometer, den Kristall an ausgewählten Orientierungen zu positionieren montiert. Der Kristall wird mit einem monochromatische Strahl von Röntgenstrahlen in allen Winkeln, produzieren ein Beugungsmuster beleuchtet. Die Software wandelt die zweidimensionalen Aufnahmen mit unterschiedlichen Ausrichtungen, um ein dreidimensionales Modell der Dichte der Elektronen im Inneren des Kristalls durch die Bestimmung der Positionen der Atome im Kristall.
Nun, da wir ein Verfahren überprüft haben, betrachten wir nun einige nützlichen Anwendungen von Protein Kristallisation und eine weitere Kristallisation Technik.
Protein-Kristallisation kann in Silico-Wirkstoff-Design zur Verfügung. Die dreidimensionale Struktur des Influenza-Virus Polymerase basic Protein 2, das auf virale Infektion bei Säugetieren verbunden worden ist, wurde durch Kristallisation und Röntgenbeugung bestimmt. Möglichen Bindungsstellen des Proteins werden visualisiert und mit dem Einsatz eines Docking-Programms, wurde eine dreidimensionale Molekül entwickelt, die in einen Spalt in das Protein einfügen würde.
Co-Kristallisation von Protein-DNA-komplexen ist auch eine nützliche Technik. DNA-bindende Proteine modulieren vielfältige biologische Funktionen wie Transkription und Polymerisation von DNA und DNA-Reparatur; und Kristallstrukturen dieser komplexe können Einblick in die Proteinfunktion, Mechanik und die Art der spezifischen Interaktion. Das E. Coli Protein SeqA, ein negativer Regulator der DNA-Replikation, war gemeinsam mit Hemimethylated DNA kristallisiert.
Integrale Membranproteine sind wie G-Protein gekoppelten Rezeptoren oder GCPRs, schwierig zu kristallisieren durch ihre begrenzte polar Fläche für bilden Kristallgitter Kontakte geführt hat zur Entwicklung des Fusion-Protein-gestützte Protein Kristallisation zur Verfügung. Genen Codierung adrenergen β2-Rezeptor, eine GCPR und ein Lysozym wurden in einem Expressionsvektor eingefügt. Die Kristallisation des Fusionsproteins β2AR-Lysozym wurde durch die erhöhte extrazelluläre hydrophile Oberfläche über die natürlich hydrophobe β2AR, zur Verfügung gestellt durch das Lysozym, notwendig zur Bildung von Verpackung Interaktionen im Kristallgitter erreicht.
Sie haben nur Jupiters Video auf Protein Kristallisation angesehen. Dieses Video beschrieben, ihre Grundsätze, ein allgemeines Protokoll und einige seiner Verwendungen im Bereich Biomedizin. Danke fürs Zuschauen!
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