Overview
בספקטרומטריית מסה דו-מושבית, ביומולקול של עניין מבודד מדגם ביולוגי, ולאחר מכן מתפצל למספר תת-קבצים על מנת לסייע לפרט את הרכבו ורצףו. זה מושג על ידי ספקטרומטרי מסה בסדרה. הספקטרומטר הראשון מיונן יון מדגם ומסנן של יחס מסה למטען מסוים. לאחר מכן יונים מסוננים מפוצלים ומועברים לספקטרומטר מסה שני שבו מנתחים את השברים.
וידאו זה מציג את העקרונות של ספקטרומטריית מסה דו-מושבית, כולל בחירת מסה ליחס ושיטות דיסוציאציה. כמו כן מוצג הליך כללי לניתוח תרכובת ביוכימית באמצעות ספקטרומטר מסה דו-מושבית עם דיסוציאציה הנגרמת מהתנגשות. סעיף היישומים מכסה ניטור תגובת בחירה, קביעת שינויים לאחר התרגום של חלבון, וזיהוי של רמות tacrolimus בדם.
ספקטרומטריית מסה טנדם מקשרת בין שלבים מרובים של ספקטרומטריית מסה כדי לבודד תחילה ביומולקול, ולאחר מכן לקבוע היבטים של ההרכב הכימי שלה. ביומולקולות יש מבנים גדולים ומורכבים, מה שמקשה על קביעת ההרכב המולקולרי שלהם. ספקטרומטריית מסה דו-מושבית בוחרת מולקולה של עניין שמפוצלת מאוחר יותר לאיחודי משנה מרובים, מה שיכול לעזור לפרט את הזיהוי והרצף שלה. וידאו זה יציג את המושגים של ספקטרומטריית מסה דו-מושבית, הליך כללי, וחלק מהשימושים בו בביוכימיה.
ספקטרומטריית מסה טנדם מתחילה ככלי מפרט מסה טיפוסי: עם מקור יונים, הממיר את המדגם ליונים, ומנתח מסה, המפריד בין היונים בהתבסס על יחס המסה למטען שלהם. מנתח מסה נפוץ, quadrupole, מאפשר רק יונים עם יחס מסוים דרך, בעוד האחרים להתרסק לתוך המוטות של המנגנון. המין המותר לעבור, הנקרא יון הקדמה, הוא הביומולקול של עניין. היון נע לתוך תא התנגשות, בדרך כלל מרובע אחר, שבו אנרגיה מוחלת כדי לפצל את היון בתבנית צפויה.
שברים אלה עוברים למנתח מסה אחר, כגון זמן טיסה, המפריד בין "יוני המוצר" האלה. לאחר מכן, יונים המוצר נשלחים לגלאי, כמו במכשיר MS רגיל. במקרה של חלבון לא ידוע, הספקטרום המתקבל מכיל שברים חופפים רבים, מה שהופך רצף מלא מוחלט של הביומולקול קשה לייצר. עם זאת, התבנית הספקטרלית ייחודית לחלבון נתון. תוכנת ניתוח משווה את הספקטרום למסד נתונים של רצפי פפטיד ידועים, המפרט את החלבון הלא ידוע מהשברים החופפים.
בהתאם לדגימה ומידת הפיצול הרצויה, שיטות פיצול מרובות אפשריות. דפוסי הפיצול תלויים באופן העברת האנרגיה, בכמותה ובאופן הפצתה באמצעות יון המבשר. ניתן להעביר אנרגיה באמצעות חלקיקים ניטרליים, קרינה או אלקטרונים. באמצעות אטומים ניטרליים, תהליך שנקרא דיסוציאציה כתוצאה מהתנגשות או CID, בעיקר דבק בקשר פפטיד בין חומצות האמינו, אידיאלי לזיהוי שלהם.
כעת, לאחר שיסודות הטכניקה כוסו, בואו נסתכל על ספקטרומטריית מסה דו-מושבית של CID המשמשת לחקר רכיב של מעטפות תאי חיידקים.
כמו בכל הניסויים ספקטרומטריים המוניים, הצעד הראשון הוא לייננות המדגם. עבור biomolecules, זה נעשה בדרך כלל עם desorption לייזר בסיוע מטריצה או יינון אלקטרוספרי. אות היונים המבשר ממוטב לאחר מכן על ידי כוונון של אופטיקת היונים. לאחר סיום, היעד מבודד ונבחרת שיטת הפיצול, כגון CID.
כוחו של מתח מיושם, אשר מאיץ את יון הקדמה לתוך תא ההתנגשות, משפיע על מידת הפיצול. מתח זה גדל עד המבשר הוא בערך 10% שפע לעומת יון המוצר הגבוה ביותר. ספקטרום מרובה נרכשים וממוצע עד יחס אות לרעש מספיק מושגת. מספר הסריקות הדרושות תלוי בעוצמת האות של יון המבשר המקורי ויכול לנוע בין 3 ל -300.
הניתוח בדוגמה זו, השומנים A מ Escherichia coli K-12, היו 19 שברים עיקריים לאחר CID. המבנה הכללי של ליפיד A ידוע היטב, ומאפשר לתוכנה לשחזר את ההרכב הספציפי מהדגימה.
עכשיו שבדקנו את ההליך, בואו נסתכל על כמה מהדרכים שבהן משתמשים בספקטרומטריית מסה דו-מושבית בביוכימיה.
מצב סריקה נפוץ בספקטרומטריית מסה דו-מושבית הוא ניטור תגובה נבחר, או SRM. ב- SRM, שני מנתחי המסה קבועים ליחס מסה לטעינה שנבחר, תוך התמקדות במבשר ספציפי ויוני מוצרים. בגלל רמת הרגישות הגבוהה של SRM, הספקטרום של תקני פפטיד של ריכוז ידוע ניתן להשתמש בהשוואה לזה של דגימות לא ידועות, המאפשר חלבונים של עניין להיות כימות.
חלבונים משתנים בדרך כלל לאחר התרגום, בדרך כלל על ידי תוספת של קבוצות פונקציונליות כגון קבוצות מתיל, קבוצות פוספט, או סוכרים, המכונה גליקנים. אלה חשובים בתהליכי איתות תאים, המהללים כיצד תאים מתקשרים זה עם זה. מכיוון שספקטרומטריית מסה דו-מושבית מפצלת את החלבונים לרכיבים קטנים יותר, ניתן לקבוע את מיקום ה- PTM לשבר הספציפי או אפילו לחומצת אמינו. שינויים מסוימים, כגון אצטילציה וטרימתילציה, קשה להבדיל באמצעות מסה בלבד, ולכן הפרדה כרומטוגרפית מבוצעת לפני ספקטרומטריית המסה.
ניתוחים רבים בדם החולה נמצאים בריכוזים מתחת לגבול הזיהוי לספקטרומטריית מסה טיפוסית. יתרון נוסף של SRM הוא שהוא משליך את כל יון המוצר מלבד אחד, מגביר את הרגישות ומשפר את מגבלת הזיהוי התחתונה בעד פי 100. בדוגמה זו, התרופה מדכאת החיסון, tacrolimus, ניתן לזהות ברמות של 1 ng / mL.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על ספקטרומטריית מסה דו-מושבית. וידאו זה תיאר את התיאוריה של המכשיר, עבר על הליך כללי, והסביר כמה מהדרכים שבהן הטכניקה מנוצלת כעת. תודה שצפיתם!
Procedure
בספקטרומטריית מסה דו-מושבית, ביומולקול של עניין מבודד מדגם ביולוגי, ולאחר מכן מתפצל למספר תת-קבצים על מנת לסייע לפרט את הרכבו ורצףו. זה מושג על ידי ספקטרומטרי מסה בסדרה. הספקטרומטר הראשון מיונן יון מדגם ומסנן של יחס מסה למטען מסוים. לאחר מכן יונים מסוננים מפוצלים ומועברים לספקטרומטר מסה שני שבו מנתחים את השברים.
וידאו זה מציג את העקרונות של ספקטרומטריית מסה דו-מושבית, כולל בחירת מסה ליחס ושיטות דיסוציאציה. כמו כן מוצג הליך כללי לניתוח תרכובת ביוכימית באמצעות ספקטרומטר מסה דו-מושבית עם דיסוציאציה הנגרמת מהתנגשות. סעיף היישומים מכסה ניטור תגובת בחירה, קביעת שינויים לאחר התרגום של חלבון, וזיהוי של רמות tacrolimus בדם.
ספקטרומטריית מסה טנדם מקשרת בין שלבים מרובים של ספקטרומטריית מסה כדי לבודד תחילה ביומולקול, ולאחר מכן לקבוע היבטים של ההרכב הכימי שלה. ביומולקולות יש מבנים גדולים ומורכבים, מה שמקשה על קביעת ההרכב המולקולרי שלהם. ספקטרומטריית מסה דו-מושבית בוחרת מולקולה של עניין שמפוצלת מאוחר יותר לאיחודי משנה מרובים, מה שיכול לעזור לפרט את הזיהוי והרצף שלה. וידאו זה יציג את המושגים של ספקטרומטריית מסה דו-מושבית, הליך כללי, וחלק מהשימושים בו בביוכימיה.
ספקטרומטריית מסה טנדם מתחילה ככלי מפרט מסה טיפוסי: עם מקור יונים, הממיר את המדגם ליונים, ומנתח מסה, המפריד בין היונים בהתבסס על יחס המסה למטען שלהם. מנתח מסה נפוץ, quadrupole, מאפשר רק יונים עם יחס מסוים דרך, בעוד האחרים להתרסק לתוך המוטות של המנגנון. המין המותר לעבור, הנקרא יון הקדמה, הוא הביומולקול של עניין. היון נע לתוך תא התנגשות, בדרך כלל מרובע אחר, שבו אנרגיה מוחלת כדי לפצל את היון בתבנית צפויה.
שברים אלה עוברים למנתח מסה אחר, כגון זמן טיסה, המפריד בין "יוני המוצר" האלה. לאחר מכן, יונים המוצר נשלחים לגלאי, כמו במכשיר MS רגיל. במקרה של חלבון לא ידוע, הספקטרום המתקבל מכיל שברים חופפים רבים, מה שהופך רצף מלא מוחלט של הביומולקול קשה לייצר. עם זאת, התבנית הספקטרלית ייחודית לחלבון נתון. תוכנת ניתוח משווה את הספקטרום למסד נתונים של רצפי פפטיד ידועים, המפרט את החלבון הלא ידוע מהשברים החופפים.
בהתאם לדגימה ומידת הפיצול הרצויה, שיטות פיצול מרובות אפשריות. דפוסי הפיצול תלויים באופן העברת האנרגיה, בכמותה ובאופן הפצתה באמצעות יון המבשר. ניתן להעביר אנרגיה באמצעות חלקיקים ניטרליים, קרינה או אלקטרונים. באמצעות אטומים ניטרליים, תהליך שנקרא דיסוציאציה כתוצאה מהתנגשות או CID, בעיקר דבק בקשר פפטיד בין חומצות האמינו, אידיאלי לזיהוי שלהם.
כעת, לאחר שיסודות הטכניקה כוסו, בואו נסתכל על ספקטרומטריית מסה דו-מושבית של CID המשמשת לחקר רכיב של מעטפות תאי חיידקים.
כמו בכל הניסויים ספקטרומטריים המוניים, הצעד הראשון הוא לייננות המדגם. עבור biomolecules, זה נעשה בדרך כלל עם desorption לייזר בסיוע מטריצה או יינון אלקטרוספרי. אות היונים המבשר ממוטב לאחר מכן על ידי כוונון של אופטיקת היונים. לאחר סיום, היעד מבודד ונבחרת שיטת הפיצול, כגון CID.
כוחו של מתח מיושם, אשר מאיץ את יון הקדמה לתוך תא ההתנגשות, משפיע על מידת הפיצול. מתח זה גדל עד המבשר הוא בערך 10% שפע לעומת יון המוצר הגבוה ביותר. ספקטרום מרובה נרכשים וממוצע עד יחס אות לרעש מספיק מושגת. מספר הסריקות הדרושות תלוי בעוצמת האות של יון המבשר המקורי ויכול לנוע בין 3 ל -300.
הניתוח בדוגמה זו, השומנים A מ Escherichia coli K-12, היו 19 שברים עיקריים לאחר CID. המבנה הכללי של ליפיד A ידוע היטב, ומאפשר לתוכנה לשחזר את ההרכב הספציפי מהדגימה.
עכשיו שבדקנו את ההליך, בואו נסתכל על כמה מהדרכים שבהן משתמשים בספקטרומטריית מסה דו-מושבית בביוכימיה.
מצב סריקה נפוץ בספקטרומטריית מסה דו-מושבית הוא ניטור תגובה נבחר, או SRM. ב- SRM, שני מנתחי המסה קבועים ליחס מסה לטעינה שנבחר, תוך התמקדות במבשר ספציפי ויוני מוצרים. בגלל רמת הרגישות הגבוהה של SRM, הספקטרום של תקני פפטיד של ריכוז ידוע ניתן להשתמש בהשוואה לזה של דגימות לא ידועות, המאפשר חלבונים של עניין להיות כימות.
חלבונים משתנים בדרך כלל לאחר התרגום, בדרך כלל על ידי תוספת של קבוצות פונקציונליות כגון קבוצות מתיל, קבוצות פוספט, או סוכרים, המכונה גליקנים. אלה חשובים בתהליכי איתות תאים, המהללים כיצד תאים מתקשרים זה עם זה. מכיוון שספקטרומטריית מסה דו-מושבית מפצלת את החלבונים לרכיבים קטנים יותר, ניתן לקבוע את מיקום ה- PTM לשבר הספציפי או אפילו לחומצת אמינו. שינויים מסוימים, כגון אצטילציה וטרימתילציה, קשה להבדיל באמצעות מסה בלבד, ולכן הפרדה כרומטוגרפית מבוצעת לפני ספקטרומטריית המסה.
ניתוחים רבים בדם החולה נמצאים בריכוזים מתחת לגבול הזיהוי לספקטרומטריית מסה טיפוסית. יתרון נוסף של SRM הוא שהוא משליך את כל יון המוצר מלבד אחד, מגביר את הרגישות ומשפר את מגבלת הזיהוי התחתונה בעד פי 100. בדוגמה זו, התרופה מדכאת החיסון, tacrolimus, ניתן לזהות ברמות של 1 ng / mL.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על ספקטרומטריית מסה דו-מושבית. וידאו זה תיאר את התיאוריה של המכשיר, עבר על הליך כללי, והסביר כמה מהדרכים שבהן הטכניקה מנוצלת כעת. תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
