Overview
La ionizzazione a desorbimento laser assistito da matrice (MALDI) è una sorgente ionica di spettrometria di massa ideale per l'analisi di biomolecole. Invece di composti ionizzanti allo stato gassoso, i campioni sono incorporati in una matrice, che viene colpita da un laser. La matrice assorbe la maggior parte dell'energia; parte di questa energia viene quindi trasferita al campione, che si ionizza di conseguenza. Gli ioni campione possono quindi essere identificati utilizzando un analizzatore di tempo di volo (TOF).
Questo video illustra i principi di MALDI-TOF, inclusa la selezione della matrice e il modo in cui TOF viene utilizzato per chiarire i rapporti massa-carica. Questa procedura mostra la preparazione di una piastra MALDI, il caricamento di campioni sulla piastra e il funzionamento dello spettrometro di massa TOF. Nella sezione finale vengono mostrate le applicazioni e le variazioni, tra cui l'analisi di cellule intere, la caratterizzazione di campioni biologici complessi e la ionizzazione a spruzzo di elettroni.
La ionizzazione a desorbimento laser assistita da matrice, o MALDI, è una sorgente ionica di spettrometria di massa ideale per l'analisi di biomolecole. La maggior parte delle fonti ioniche rimuove le informazioni strutturali da biomolecole grandi e fragili. MALDI mantiene l'integrità strutturale, e quindi le informazioni, mentre accelera le molecole nell'analizzatore di massa, che separa i composti in base alle dimensioni e alla carica. Il più comunemente accoppiato con MALDI è il tempo di volo, o TOF, analizzatore di massa. Questo video mostrerà i concetti di ionizzazione MALDI, una procedura generale, e alcuni dei suoi usi in biochimica.
Affinché la spettrometria di massa funzioni, le molecole devono essere ionizzate allo stato gassoso. In MALDI, il campione è incorporato in una matrice, tipicamente un composto organico contenente doppi legami aromatici e coniugati.
Quando un impulso laser colpisce questa miscela, la matrice assorbe la maggior parte dell'energia, si riscalda rapidamente e viene desorbita, o rilasciata, dalla superficie. La matrice energizzata trasferisce parte della sua energia alle biomolecole, desorbendole e quindi ionizzandole.
MALDI è in genere abbinato a un analizzatore di massa time of flight, o TOF. Un campo elettrico applica energia cinetica agli ioni, spostandoli in una regione priva di campo chiamata tubo di deriva. La velocità degli ioni mentre si muovono attraverso il tubo è correlata al loro rapporto massa-carica, quindi le particelle più pesanti viaggiano più lentamente attraverso lo strumento. Un rilevatore all'estremità del tubo misura il tempo di volo di ogni ione. Con questa conoscenza, così come la lunghezza del tubo e l'intensità del campo applicato, è possibile chiarire il rapporto massa-carica di ciascun ione.
Questo grafico dell'intensità del segnale rispetto al rapporto massa-carica, noto come spettro di massa, può essere paragonato a una libreria di spettri raccolti. Se non vengono trovate corrispondenze, le molecole possono essere identificate con ulteriori tecniche, come la spettrometria di massa tandem. Per ulteriori informazioni, vedere il video di questa raccolta sull'argomento.
Ora che le basi di MALDI-TOF sono state discusse, diamo un'occhiata al processo in laboratorio.
Prima di iniziare un esperimento, è importante considerare la scelta della matrice da cui i campioni verranno desorbiti. Deve assorbire l'energia del laser, essere stabile nel vuoto, non reagire con le molecole bersaglio ed essere in grado di desorbire. A seconda del campione, sono preferite matrici diverse. Per una proteina di grandi dimensioni, una combinazione di CHCA e DHB ha mostrato una migliore separazione dei picchi, chiamata risoluzione, rispetto alle singole matrici.
Esistono diversi modi per preparare i campioni. Mostreremo ciò che è noto come il metodo "doppio strato" o "sandwich". Per iniziare, pulire la piastra MALDI con reagenti ultrapuri, poiché la spettrometria di massa è molto sensibile alla contaminazione. Asciugare la piastra con un flusso di gas inerte.
Successivamente, viene prodotta una soluzione a matrice satura, in genere con un solvente organico . La soluzione viene striata sulla piastra MALDI e asciugata. Viene preparata una seconda soluzione satura di matrice contenente acido trifluoroacetico o TFA. TFA aiuta gli ioni nella fase gassosa.
Successivamente, la soluzione campione viene aggiunta sopra il punto della matrice essiccata. Aggiungere la soluzione di matrice contenente TFA sopra il campione, completando così il "sandwich" della matrice. L'omogeneità dello spot può essere verificata al microscopio a bassa potenza.
Piastra uno standard di calibrazione, che è una miscela con una vasta gamma di masse conosciute e viene utilizzato per correlare il tempo di volo a m / z. Infine, placcare la matrice da sola come controllo negativo.
Per analizzare i punti, posizionare la piastra target nello strumento. Assicurarsi che non siano presenti detriti, consentendo la formazione di un vuoto stretto. Nel software, selezionare lo standard, il controllo negativo e i campioni di interesse. Etichettare le macchie con la corretta identificazione.
La sorgente iomica e le tensioni della lente possono essere manipolate per migliorare le prestazioni dell'analisi. Ciò dipenderà dalle specifiche dello strumento e del campione. Concentrati sullo spot standard e calibra lo strumento con il software.
Quindi, raccogliere spettri da ciascuno dei punti campione. Prova alcune posizioni diverse sul posto per massimizzare la qualità dei dati raccolti. Una volta terminata, la piastra MALDI può essere raccolta e riutilizzata dopo la pulizia.
Ora che abbiamo esaminato una procedura, diamo un'occhiata ad alcuni dei modi in cui viene utilizzato MALDI e una diversa tecnica di ionizzazione.
Oltre alle biomolecole, MALDI può essere utilizzato per analizzare le cellule viventi. I macrofagi sono cellule immunitarie che assumono una delle diverse forme, in base al loro microambiente. Dopo aver esposto le cellule a varie molecole di segnalazione, o citochine, possono essere aggiunte direttamente alla piastra e analizzate. Gli spettri MALDI possono essere utilizzati come "impronte digitali" uniche, a seconda della citochina utilizzata.
Campioni biologici complessi come le secrezioni sebacee dei mammiferi richiedono una fase di purificazione prima dell'analisi MALDI. La cromatografia su strato sottile è una di queste tecniche che si basa sulla polarità dei componenti. I composti vengono raccolti dal patè TLC, purificati e trasferiti in una matrice MALDI. Gli spettri risultanti verificano l'identità e la purezza delle biomolecole separate dalle secrezioni sebacee dei mammiferi.
Un'altra fonte di ioni comune per le biomolecole è la ionizzazione elettrospray, o ESI. In questo metodo, il campione viene iniettato nello strumento, dove viene applicata un'alta tensione, creando un aerosol di goccioline cariche. Quando il solvente nella goccia evapora, la carica viene spostata sulle molecole del campione, fino a quando non sono completamente gassose. ESI non richiede la procedura di spotting e il campione può essere iniettato direttamente nello strumento. D'altra parte, ESI è più sensibile alla presenza di componenti tampone e altri contaminanti, il che significa che MALDI è più robusto.
Hai appena visto il video di JoVE sulla spettrometria di massa MALDI. Questo video descriveva la teoria alla base dello strumento, andava oltre una procedura generale e copriva alcuni degli usi della tecnica. Grazie per l'attenzione!
Procedure
La ionizzazione a desorbimento laser assistito da matrice (MALDI) è una sorgente ionica di spettrometria di massa ideale per l'analisi di biomolecole. Invece di composti ionizzanti allo stato gassoso, i campioni sono incorporati in una matrice, che viene colpita da un laser. La matrice assorbe la maggior parte dell'energia; parte di questa energia viene quindi trasferita al campione, che si ionizza di conseguenza. Gli ioni campione possono quindi essere identificati utilizzando un analizzatore di tempo di volo (TOF).
Questo video illustra i principi di MALDI-TOF, inclusa la selezione della matrice e il modo in cui TOF viene utilizzato per chiarire i rapporti massa-carica. Questa procedura mostra la preparazione di una piastra MALDI, il caricamento di campioni sulla piastra e il funzionamento dello spettrometro di massa TOF. Nella sezione finale vengono mostrate le applicazioni e le variazioni, tra cui l'analisi di cellule intere, la caratterizzazione di campioni biologici complessi e la ionizzazione a spruzzo di elettroni.
La ionizzazione a desorbimento laser assistita da matrice, o MALDI, è una sorgente ionica di spettrometria di massa ideale per l'analisi di biomolecole. La maggior parte delle fonti ioniche rimuove le informazioni strutturali da biomolecole grandi e fragili. MALDI mantiene l'integrità strutturale, e quindi le informazioni, mentre accelera le molecole nell'analizzatore di massa, che separa i composti in base alle dimensioni e alla carica. Il più comunemente accoppiato con MALDI è il tempo di volo, o TOF, analizzatore di massa. Questo video mostrerà i concetti di ionizzazione MALDI, una procedura generale, e alcuni dei suoi usi in biochimica.
Affinché la spettrometria di massa funzioni, le molecole devono essere ionizzate allo stato gassoso. In MALDI, il campione è incorporato in una matrice, tipicamente un composto organico contenente doppi legami aromatici e coniugati.
Quando un impulso laser colpisce questa miscela, la matrice assorbe la maggior parte dell'energia, si riscalda rapidamente e viene desorbita, o rilasciata, dalla superficie. La matrice energizzata trasferisce parte della sua energia alle biomolecole, desorbendole e quindi ionizzandole.
MALDI è in genere abbinato a un analizzatore di massa time of flight, o TOF. Un campo elettrico applica energia cinetica agli ioni, spostandoli in una regione priva di campo chiamata tubo di deriva. La velocità degli ioni mentre si muovono attraverso il tubo è correlata al loro rapporto massa-carica, quindi le particelle più pesanti viaggiano più lentamente attraverso lo strumento. Un rilevatore all'estremità del tubo misura il tempo di volo di ogni ione. Con questa conoscenza, così come la lunghezza del tubo e l'intensità del campo applicato, è possibile chiarire il rapporto massa-carica di ciascun ione.
Questo grafico dell'intensità del segnale rispetto al rapporto massa-carica, noto come spettro di massa, può essere paragonato a una libreria di spettri raccolti. Se non vengono trovate corrispondenze, le molecole possono essere identificate con ulteriori tecniche, come la spettrometria di massa tandem. Per ulteriori informazioni, vedere il video di questa raccolta sull'argomento.
Ora che le basi di MALDI-TOF sono state discusse, diamo un'occhiata al processo in laboratorio.
Prima di iniziare un esperimento, è importante considerare la scelta della matrice da cui i campioni verranno desorbiti. Deve assorbire l'energia del laser, essere stabile nel vuoto, non reagire con le molecole bersaglio ed essere in grado di desorbire. A seconda del campione, sono preferite matrici diverse. Per una proteina di grandi dimensioni, una combinazione di CHCA e DHB ha mostrato una migliore separazione dei picchi, chiamata risoluzione, rispetto alle singole matrici.
Esistono diversi modi per preparare i campioni. Mostreremo ciò che è noto come il metodo "doppio strato" o "sandwich". Per iniziare, pulire la piastra MALDI con reagenti ultrapuri, poiché la spettrometria di massa è molto sensibile alla contaminazione. Asciugare la piastra con un flusso di gas inerte.
Successivamente, viene prodotta una soluzione a matrice satura, in genere con un solvente organico . La soluzione viene striata sulla piastra MALDI e asciugata. Viene preparata una seconda soluzione satura di matrice contenente acido trifluoroacetico o TFA. TFA aiuta gli ioni nella fase gassosa.
Successivamente, la soluzione campione viene aggiunta sopra il punto della matrice essiccata. Aggiungere la soluzione di matrice contenente TFA sopra il campione, completando così il "sandwich" della matrice. L'omogeneità dello spot può essere verificata al microscopio a bassa potenza.
Piastra uno standard di calibrazione, che è una miscela con una vasta gamma di masse conosciute e viene utilizzato per correlare il tempo di volo a m / z. Infine, placcare la matrice da sola come controllo negativo.
Per analizzare i punti, posizionare la piastra target nello strumento. Assicurarsi che non siano presenti detriti, consentendo la formazione di un vuoto stretto. Nel software, selezionare lo standard, il controllo negativo e i campioni di interesse. Etichettare le macchie con la corretta identificazione.
La sorgente iomica e le tensioni della lente possono essere manipolate per migliorare le prestazioni dell'analisi. Ciò dipenderà dalle specifiche dello strumento e del campione. Concentrati sullo spot standard e calibra lo strumento con il software.
Quindi, raccogliere spettri da ciascuno dei punti campione. Prova alcune posizioni diverse sul posto per massimizzare la qualità dei dati raccolti. Una volta terminata, la piastra MALDI può essere raccolta e riutilizzata dopo la pulizia.
Ora che abbiamo esaminato una procedura, diamo un'occhiata ad alcuni dei modi in cui viene utilizzato MALDI e una diversa tecnica di ionizzazione.
Oltre alle biomolecole, MALDI può essere utilizzato per analizzare le cellule viventi. I macrofagi sono cellule immunitarie che assumono una delle diverse forme, in base al loro microambiente. Dopo aver esposto le cellule a varie molecole di segnalazione, o citochine, possono essere aggiunte direttamente alla piastra e analizzate. Gli spettri MALDI possono essere utilizzati come "impronte digitali" uniche, a seconda della citochina utilizzata.
Campioni biologici complessi come le secrezioni sebacee dei mammiferi richiedono una fase di purificazione prima dell'analisi MALDI. La cromatografia su strato sottile è una di queste tecniche che si basa sulla polarità dei componenti. I composti vengono raccolti dal patè TLC, purificati e trasferiti in una matrice MALDI. Gli spettri risultanti verificano l'identità e la purezza delle biomolecole separate dalle secrezioni sebacee dei mammiferi.
Un'altra fonte di ioni comune per le biomolecole è la ionizzazione elettrospray, o ESI. In questo metodo, il campione viene iniettato nello strumento, dove viene applicata un'alta tensione, creando un aerosol di goccioline cariche. Quando il solvente nella goccia evapora, la carica viene spostata sulle molecole del campione, fino a quando non sono completamente gassose. ESI non richiede la procedura di spotting e il campione può essere iniettato direttamente nello strumento. D'altra parte, ESI è più sensibile alla presenza di componenti tampone e altri contaminanti, il che significa che MALDI è più robusto.
Hai appena visto il video di JoVE sulla spettrometria di massa MALDI. Questo video descriveva la teoria alla base dello strumento, andava oltre una procedura generale e copriva alcuni degli usi della tecnica. Grazie per l'attenzione!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
