Overview
קינטיקה אנזימים מתארת את ההשפעות קטליטיות של אנזימים, שהם ביומולקולים המאפשרים תגובות כימיות הדרושות לאורגניזמים חיים. אנזימים פועלים על מולקולות, המכונות מצעים, כדי ליצור מוצרים. פרמטרים קינטיים אנזים נקבעים באמצעות התקפות כי במישרין או בעקיפין למדוד שינויים מצע או ריכוז המוצר לאורך זמן.
וידאו זה יכסה את העקרונות הבסיסיים של קינטיקה אנזימים (כולל משוואות קצב) ומודלים קינטיים. המושגים השולטים על עשיית אנזימים נדונים גם הם, ואחריו תימונת צבע אופיינית. סעיף היישומים דן בבדיקת אנזימים באמצעות ניתוח העברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET), המאפיין פעילות אנזימים חוץ-תאיים בסביבה, וחוקר קינטיקה לתיקון דנ"א באמצעות בדיקות מולקולריות.
אנזימים הם זרזים ביוכימיים החיוניים לחיים. אנזים assays משמשים כדי ללמוד את המאפיינים הקינטיים של תגובות אנזימטיות, המהורהר את ההשפעות קטליטיות של אנזימים. וידאו זה יכסה קינטיקה אנזים ובוחות, לעבור על הליך כללי, ולהראות כמה יישומים.
אנזימים הם חלבונים, או לעתים קרובות פחות RNAs, הפועלים על מגיב מסוים, המכונה המצע. אנזים מפחית את אנרגיית ההפעלה הדרושה ליזום תגובה ביוכימית, וגורם לתגובה להתרחש בקצב מהיר יותר.
ניתן לחלק תגובות אנזימטיות לשלושה מרכיבים יסודיים. הראשון הוא היווצרות של קומפלקס מצע האנזים, שנוצר על ידי כריכת המצע לאתר הפעיל של האנזים. המתחם יכול להתפרק לתוך הבוחרים המקוריים שלו. זו התגובה היסודית השנייה. לחלופין, המתחם יכול ליצור את המוצר ולשחזר את האנזים, התגובה היסודית השלישית.
הקינטיקה של תגובה יסודית ניתנת על ידי משוואת חוק השיעור היסודי. משוואות חוק התעריפים נותנות את השיעור במונחים של ריכוז המגיבים וקבוע קצב. לכל אחת מהתגובות היסודיות יש משוואת חוק שיעור בודדת, עם קצב קבוע משלה. משוואות אלה יכולות להיות מזוקקות עד למודל קינטי המכונה משוואת מיכאליס-מינטן. זה נותן את שיעור התגובה במונחים של ריכוז המצע; אשר ניתן לקבוע באופן ניסיוני. כמה מגמות כלליות לתגובות אנזימים ניתן לזהות באמצעות משוואת מיכאליס-מנטן. בריכוז מצע גבוה, נקודת רוויה מגיעה, הנקראת Vmax. כאן, הקצב מוגבל על ידי ריכוז האנזים הכולל, ומספר מולקולות המצע שאנזים ממיר למוצר לכל זמן נתון, הידוע גם בשםk cat. ב מיכאליס-מנטן קינטיקהk חתול הוא אחד משני הקבועים השולטים בשיעור התגובה. הקבוע האחר, KM, ידוע כקבוע הזיקה. KM שווה גם לריכוז שבו שיעור התגובה שווה לחצי Vמקסימום . אנזים עם זיקה גבוהה יותר יהיה ק"מ נמוך יותר להגיע Vמקסימום מהר יותר, בעוד אנזים עם זיקה נמוכה יותר יהיה ק"מ גבוה יותר לקחת יותר זמן להגיע Vמקסימום. הכרתk חתול ו KM מאפשר אנזימים להיות משווים. כדי לעשות זאת אנו משתמשים ביחס הנקרא יעילות אנזימים. חתול k גבוה יותר ו- KM נמוך יותר גורמים ליעילות גבוהה יותר, בעודשחתול k נמוך יותר ו- KM גבוה יותר מביאים לתוצאות נמוכות יותר.
הגורמים המשמשים לבירוק קינטיקה אנזימים חייבים להיקבע באופן ניסיוני. בדיקות אלה מבוצעות בדרך כלל על ידי ערבוב אנזים ופתרון מצע בסביבה מבוקרת. תצפיות נעשות על ידי מדידת השינויים בריכוז של המצע, המוצר, או תוצרי לוואי ביחס לזמן.
השינוי בריכוז לאורך זמן משמש לקביעת קצב התגובה. על מנת לקבוע את הקינטיקה, יש להשיג נתוני שיעור בריכוזים מרובים. אם עלילה של הקצב ההתחלתי ההופכי לעומת הריכוז ההתחלתי ההופכי, המכונה עלילת Lineweaver-Burk, היא ליניארית, אז התגובה עוקבת אחר הקינטיקה של מיכאליס-מנטן. השיפוע והיירוט של הקו מאפשרים קביעת הפרמטרים הקינטיים KM ו- Vmax, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם כדי לחשבאת k cat ואת יעילות האנזים.
כעת, לאחר שעקרונות הקינטיקה של האנזים נדונו, בואו נבחן כיצד מתבצעת מבחן אנזימים טיפוסי.
בהליך זה מודגמת תימוץ צבע. הצעד הראשון הוא ליצור עקומה סטנדרטית, אשר יהיה בקורלציה ספיגה עם ריכוז מצע. פתרונות של ריכוז ידוע מוכנים יחד עם מדגם בקרה. פתרון מפתח המגיב עם המצע מתווסף כדי לייצר תרכובת צבעונית. ספיגה נמדדת ומתווות נגד ריכוז כדי ליצור את העקומה הסטנדרטית.
כדי לבצע את ההסתה, ריכוז ידוע של מצע מוכן יחד עם הכמות המתאימה של אנזים. האנזים והמצע מעורבים ומותר להם לדגור לפרק זמן מוגדר. pH וטמפרטורה נשלטים עם פתרונות חיץ ובלוקי חימום. סוכן מרווה נוסף כדי לעצור את התגובה. פתרון המפתחים מתווסף לאחר מכן לתגובות ומעורב. לאחר מכן הפתרונות ממוקמים בקובטים והספיגה נמדדת. כמות המצע הנצרכת נקבעת על ידי השוואת הספיגה הנמדדת לעקומה הסטנדרטית. באמצעות הנתונים שנאספו, שיעורי התגובה הראשוניים נקבעים על ידי התוויית ריכוז לאורך זמן. לבסוף, עם נתוני הקצב והריכוז, העלילה של מיכאליס-מינטן נעשית. זה מאפשר קביעת תכונות קינטיות עבור האנזים כגון מספר מחזור ויעילות אנזימים.
עכשיו שבדקנו הליך בדיקה, בואו נסתכל על דרכים אחרות לבצע הבדיקות ואת היישומים שלהם.
בהליך זה ניתוח FRET משמש כדי ללמוד את הקינטיקה של פרוטאז הידרוליזה קשר פפטיד של חלבון. ניתן למדוד פליטות אלה, המאפשר ניתוח רציף וכמותי של צריכת מצע וייצור, בסיוע בקביעת קינטיקה התגובה.
בדיקות אנזימים ניתן להשתמש במדעי הסביבה כדי לקבוע את רמות פעילות האנזים חוץ תאי בסביבה. ניתן לאסוף מים, קרקעות ומשקעים מהסביבה ולעבד אותם במעבדה. פעילות אנזימטית חוץ תאית של חומרים אלה לאחר מכן ניתן לאפיין באמצעות אנזים assays. זהו כלי שימושי להבנת האופן שבו הסביבה מעבדת חומר אורגני.
מנגנון תיקון ה- DNA של התא ניתן להעריך על ידי לימוד הקינטיקה של אנזימים שנמצאו בגרעין. ניתן למדוד את הקצב שבו אנזים מסיר נגעים בדנ"א, או נזקים, באמצעות משואות מולקולריות פלואורסצנטיות, אשר פלואורסצ'ה רק כאשר הם קשורים לרצפי DNA ייחודיים. ניתן למדוד את רמת תיקון הדנ"א בזמן אמת על ידי זיהוי מוצרי המחשוף המסומנים באופן פלואורסצנטי.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על אנזימים קינטיקה ובדיונים. וידאו זה הסביר קינטיקה אנזים, מכוסה מושגי אסאי, עבר על הליך כללי, ותיאר כמה יישומים.
תודה שצפיתם!
Procedure
קינטיקה אנזימים מתארת את ההשפעות קטליטיות של אנזימים, שהם ביומולקולים המאפשרים תגובות כימיות הדרושות לאורגניזמים חיים. אנזימים פועלים על מולקולות, המכונות מצעים, כדי ליצור מוצרים. פרמטרים קינטיים אנזים נקבעים באמצעות התקפות כי במישרין או בעקיפין למדוד שינויים מצע או ריכוז המוצר לאורך זמן.
וידאו זה יכסה את העקרונות הבסיסיים של קינטיקה אנזימים (כולל משוואות קצב) ומודלים קינטיים. המושגים השולטים על עשיית אנזימים נדונים גם הם, ואחריו תימונת צבע אופיינית. סעיף היישומים דן בבדיקת אנזימים באמצעות ניתוח העברת אנרגיית תהודה של Förster (FRET), המאפיין פעילות אנזימים חוץ-תאיים בסביבה, וחוקר קינטיקה לתיקון דנ"א באמצעות בדיקות מולקולריות.
אנזימים הם זרזים ביוכימיים החיוניים לחיים. אנזים assays משמשים כדי ללמוד את המאפיינים הקינטיים של תגובות אנזימטיות, המהורהר את ההשפעות קטליטיות של אנזימים. וידאו זה יכסה קינטיקה אנזים ובוחות, לעבור על הליך כללי, ולהראות כמה יישומים.
אנזימים הם חלבונים, או לעתים קרובות פחות RNAs, הפועלים על מגיב מסוים, המכונה המצע. אנזים מפחית את אנרגיית ההפעלה הדרושה ליזום תגובה ביוכימית, וגורם לתגובה להתרחש בקצב מהיר יותר.
ניתן לחלק תגובות אנזימטיות לשלושה מרכיבים יסודיים. הראשון הוא היווצרות של קומפלקס מצע האנזים, שנוצר על ידי כריכת המצע לאתר הפעיל של האנזים. המתחם יכול להתפרק לתוך הבוחרים המקוריים שלו. זו התגובה היסודית השנייה. לחלופין, המתחם יכול ליצור את המוצר ולשחזר את האנזים, התגובה היסודית השלישית.
הקינטיקה של תגובה יסודית ניתנת על ידי משוואת חוק השיעור היסודי. משוואות חוק התעריפים נותנות את השיעור במונחים של ריכוז המגיבים וקבוע קצב. לכל אחת מהתגובות היסודיות יש משוואת חוק שיעור בודדת, עם קצב קבוע משלה. משוואות אלה יכולות להיות מזוקקות עד למודל קינטי המכונה משוואת מיכאליס-מינטן. זה נותן את שיעור התגובה במונחים של ריכוז המצע; אשר ניתן לקבוע באופן ניסיוני. כמה מגמות כלליות לתגובות אנזימים ניתן לזהות באמצעות משוואת מיכאליס-מנטן. בריכוז מצע גבוה, נקודת רוויה היא הגיעה, הנקראת Vmax. כאן, השיעור מוגבל על ידי ריכוז האנזים הכולל, ומספר מולקולות המצע שאנזים ממיר למוצר בכל זמן נתון, הידוע גם בשםk cat. ב מיכאליס-מנטן קינטיקהk חתול הוא אחד משני הקבועים השולטים בשיעור התגובה. הקבוע האחר, KM, ידוע כקבוע הזיקה. KM שווה גם לריכוז שבו שיעור התגובה שווה לחצי Vמקסימום . אנזים עם זיקה גבוהה יותר יהיה ק"מ נמוך יותר להגיע Vמקסימום מהר יותר, בעוד אנזים עם זיקה נמוכה יותר יהיה ק"מ גבוה יותר לקחת יותר זמן להגיע Vמקסימום. הכרתk חתול ו KM מאפשר אנזימים להיות משווים. כדי לעשות זאת אנו משתמשים ביחס הנקרא יעילות אנזימים. חתול k גבוה יותר ו- KM נמוך יותר גורמים ליעילות גבוהה יותר, בעודשחתול k נמוך יותר ו- KM גבוה יותר מביאים לתוצאות נמוכות יותר.
הגורמים המשמשים לבירוק קינטיקה אנזימים חייבים להיקבע באופן ניסיוני. בדיקות אלה מבוצעות בדרך כלל על ידי ערבוב אנזים ופתרון מצע בסביבה מבוקרת. תצפיות נעשות על ידי מדידת השינויים בריכוז של המצע, המוצר, או תוצרי לוואי ביחס לזמן.
השינוי בריכוז לאורך זמן משמש לקביעת קצב התגובה. על מנת לקבוע את הקינטיקה, יש להשיג נתוני שיעור בריכוזים מרובים. אם עלילה של הקצב ההתחלתי ההופכי לעומת הריכוז ההתחלתי ההופכי, המכונה עלילת Lineweaver-Burk, היא ליניארית, אז התגובה עוקבת אחר הקינטיקה של מיכאליס-מנטן. השיפוע והיירוט של הקו מאפשרים קביעת הפרמטרים הקינטיים KM ו- Vmax, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם כדי לחשבאת k cat ואת יעילות האנזים.
כעת, לאחר שעקרונות הקינטיקה של האנזים נדונו, בואו נבחן כיצד מתבצעת מבחן אנזימים טיפוסי.
בהליך זה מודגמת תימוץ צבע. הצעד הראשון הוא ליצור עקומה סטנדרטית, אשר יהיה בקורלציה ספיגה עם ריכוז מצע. פתרונות של ריכוז ידוע מוכנים יחד עם מדגם בקרה. פתרון מפתח המגיב עם המצע מתווסף כדי לייצר תרכובת צבעונית. ספיגה נמדדת ומתווות נגד ריכוז כדי ליצור את העקומה הסטנדרטית.
כדי לבצע את ההסתה, ריכוז ידוע של מצע מוכן יחד עם הכמות המתאימה של אנזים. האנזים והמצע מעורבים ומותר להם לדגור לפרק זמן מוגדר. pH וטמפרטורה נשלטים עם פתרונות חיץ ובלוקי חימום. סוכן מרווה נוסף כדי לעצור את התגובה. פתרון המפתחים מתווסף לאחר מכן לתגובות ומעורב. לאחר מכן הפתרונות ממוקמים בקובטים והספיגה נמדדת. כמות המצע הנצרכת נקבעת על ידי השוואת הספיגה הנמדדת לעקומה הסטנדרטית. באמצעות הנתונים שנאספו, שיעורי התגובה הראשוניים נקבעים על ידי התוויית ריכוז לאורך זמן. לבסוף, עם נתוני הקצב והריכוז, העלילה של מיכאליס-מינטן נעשית. זה מאפשר קביעת תכונות קינטיות עבור האנזים כגון מספר מחזור ויעילות אנזימים.
עכשיו שבדקנו הליך בדיקה, בואו נסתכל על דרכים אחרות לבצע הבדיקות ואת היישומים שלהם.
בהליך זה ניתוח FRET משמש כדי ללמוד את הקינטיקה של פרוטאז הידרוליזה קשר פפטיד של חלבון. ניתן למדוד פליטות אלה, המאפשר ניתוח רציף וכמותי של צריכת מצע וייצור, בסיוע בקביעת קינטיקה התגובה.
בדיקות אנזימים ניתן להשתמש במדעי הסביבה כדי לקבוע את רמות פעילות האנזים חוץ תאי בסביבה. ניתן לאסוף מים, קרקעות ומשקעים מהסביבה ולעבד אותם במעבדה. פעילות אנזימטית חוץ תאית של חומרים אלה לאחר מכן ניתן לאפיין באמצעות אנזים assays. זהו כלי שימושי להבנת האופן שבו הסביבה מעבדת חומר אורגני.
מנגנון תיקון ה- DNA של התא ניתן להעריך על ידי לימוד הקינטיקה של אנזימים שנמצאו בגרעין. ניתן למדוד את הקצב שבו אנזים מסיר נגעים בדנ"א, או נזקים, באמצעות משואות מולקולריות פלואורסצנטיות, אשר פלואורסצ'ה רק כאשר הם קשורים לרצפי DNA ייחודיים. ניתן למדוד את רמת תיקון הדנ"א בזמן אמת על ידי זיהוי מוצרי המחשוף המסומנים באופן פלואורסצנטי.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על אנזימים קינטיקה ובדיונים. וידאו זה הסביר קינטיקה אנזים, מכוסה מושגי אסאי, עבר על הליך כללי, ותיאר כמה יישומים.
תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
