Overview
전기 전광 이동성 이동 분석법 (EMSA)은 단백질과 핵산 사이의 결합을 해명하는 데 사용되는 생화학 적 절차입니다. 이 분석에서 방사성 표지 핵산 및 테스트 단백질이 혼합된다. 결합은 질량, 전하 및 변형에 기초한 구성요소를 분리하는 젤 전기전이를 통해 결정됩니다.
이 비디오는 EMSA의 개념과 겔 및 단백질 제제, 결합, 전기 전동 및 검출을 포함한 일반적인 절차를 보여줍니다. 이 비디오에서 다루는 응용 프로그램은 크로마틴 리모델링 효소의 분석, 이중 자극을 통합 수정 된 EMSA, 세균 반응 조절기의 결합 사이트의 연구를 포함한다.
EMSA, 전기 이동성 이동 분석, 또한 젤 시프트 분석으로 알려진, 다재 다능하고 민감한 생화학 적 절차입니다. EMSA는 젤 전기포고증의 대역의 변화를 감지하여 단백질과 핵산 사이의 결합을 해명한다.
이 비디오는 EMSA의 원리에 대해 설명하고, 일반 절차를 제공하며, 일부 응용 프로그램에 대해 설명합니다.
DNA 복제, 전사 및 수리뿐만 아니라 RNA 처리는 모두 중요한 생화학 적 과정입니다. 그(것)들은 모두 단백질과 핵산 사이 결합을 관련시킵니다. 많은 심각한 질병 및 장애는이 바인딩의 수정과 관련이 있습니다. EMSA는 특정 단백질이 특정 핵산에 결합하는지 여부를 질적으로 결정하는 기술입니다. 첫째, 핵산은 일반적으로 방사성 인-32로 표지되어 프로브를 생성한다. 그런 다음 시험 단백질과 핵산 프로브가 혼합된다. 단백질이 핵산 프로브에 결합될 때, 결과 복합체는 핵산 단독으로더 큰 질량 및 다른 형성을 갖는다.
일단 결합되면, 복합체는 겔 전기전구로 분석됩니다. 이 기술에서 전기장은 거대 분자가 젤 매트릭스를 통해 이동하도록 강요합니다. 구성 요소는 질량, 충전 및 변형에 따라 분리됩니다. 전기 전구는 단백질 DNA 복합체를 결합되지 않은 프로브와 분리할 수 있습니다. 그들은 다른 질량과 순응을 가지고 있기 때문에, 그들은 다른 속도로 젤을 통해 마이그레이션하고 분리합니다. 분리는 방사성 인의 존재 덕분에 쉽게 검출되고, 단백질이 주어진 핵산에 성공적으로 결합한다는 것을 증명한다. 단백질의 식별을 확인하기 위해 "슈퍼 변속 분석"은 단백질에 알려진 친화력을 가진 항체를 사용합니다. 이것은 복잡한 을 더 이동하여 해상도를 증가시키는 추가이 있습니다.
이제 우리는 원리를 보았으니, 실험실에서 보자.
절차를 시작하려면 단백질을 분리해야합니다. 이렇게 하려면 분자 생물학 기술이 세포에서 단백질을 표현한 다음 정화하는 데 사용됩니다.
핵산은 증폭되고 프로브를 만들기 위하여 표지됩니다. 라벨링은 방사성 인-32를 포함하는 dCTP로 10분 동안 배양을 통해 수행됩니다. 방사능 안전 워크벤치와 보호 장비가 필요합니다.
젤은 다음 준비됩니다. 젤은 단백질이 변형을 변화시키지 못하게하고 전기 포근 중 프로브에서 잠재적으로 결합하지 않도록 비 데칭이 필요합니다. 폴리아크릴아미드 젤은 5~20nm의 모공 크기를 가지고 있으며 길이가 최대 100개의 기본 쌍을 단층프로브에 유용합니다. 아가로즈 젤은 70-700 nm의 모공 크기를 가지고 있으며 더 큰 프로브에 유용합니다.
단백질과 핵산 프로브가 준비되면서 결합을 진행합니다. TRIS 완충액이 준비되고 단백질과 프로브가 추가됩니다. pH는 비표적 핵산과의 약한 결합을 형성하는 단백질을 방지하기에 충분한 생리적 조건 및 소금 농도와 유사해야 한다. 반응은 4°C에서 20-30분 동안 진행됩니다.
다음 단계는 전기 전동입니다. 결합 반응에 사용되는 것과 유사한 낮은 이온 강도 및 pH의 완충제가 활용된다. 복합체를 안정시키고 이동성을 증가시키며 열 발생을 줄이는 "caging 효과"를 생성합니다. 전기 전도 후, 젤의 구성 요소는 필터 용지에 전달됩니다. 어두운 방에서 필터 용지가 필름에 노출됩니다. 단백질이 프로브에 결합하는 경우에, 2개의 뚜렷한 표지된 지구는 전송에서 보일 것입니다. 복합체를 나타내는 하나, 그리고 언바운드 프로브를 나타내는 별도의 프로브. 분리는 단백질이 핵산에 성공적으로 결합한다는 것을 보여줍니다.
이제 기본 절차를 살펴보셨으니 일부 응용 프로그램을 살펴보겠습니다.
크로마틴은 진핵세포를 발견한 DNA와 단백질의 단단히 포장된 복합체이다. 크로마틴 리모델링 효소는 DNA를 전사로 열어 구조를 수정합니다. 이 복합체의 이동성을 변경함에 따라 EMSA는 효소의 결합 활성을 탐구하는 데 사용할 수 있습니다.
라벨링에 대한 대체 접근법은 DNA와 메틸 트랜스퍼라제 효소 사이의 상호 작용을 활용합니다. 공동 요소는 메틸 트랜스퍼라아제(methyltransferase)를 통해 DNA에 영구적으로 결합하도록 수정될 수 있다. 인-32로 라벨을 붙이기보다는, 공동 요소는 방사성이 아니기 때문에 유리하게 비오틴에 공주됩니다. 공동 요소는 그것의 첨부 파일에서 사이트 특이적 이기 때문에, 그것은 유전자 인식, 메틸화 검출 및 유전자 납품과 관련이 있습니다. 비오티뉴클레스산은 자외선 형광을 통해 검출된다.
환경 자극이 히스티딘 키나아제 활성화되면 "응답 레귤레이터"가 인광됩니다. 이것은 차례로 EMSA에 의해 공부될 수 있는 전사에 영향을 미치는 DNA에 결합합니다. 예를 들면, Desulfovibrio 저속한에 있는 반응 레귤레이터는 관심있는 유전자에 결합하기 위하여 입증되었습니다. EMSA는 바인딩이 이루어졌는지 확인하는 데 사용되었습니다.
당신은 전기 전동 이동성 변화 분석에 JoVE의 비디오를 보았다. 이제 운영 원칙, 절차의 단계 및 주요 작동 매개 변수를 이해해야 합니다.
시청해 주셔서 감사합니다!
Procedure
전기 전광 이동성 이동 분석법 (EMSA)은 단백질과 핵산 사이의 결합을 해명하는 데 사용되는 생화학 적 절차입니다. 이 분석에서 방사성 표지 핵산 및 테스트 단백질이 혼합된다. 결합은 질량, 전하 및 변형에 기초한 구성요소를 분리하는 젤 전기전이를 통해 결정됩니다.
이 비디오는 EMSA의 개념과 겔 및 단백질 제제, 결합, 전기 전동 및 검출을 포함한 일반적인 절차를 보여줍니다. 이 비디오에서 다루는 응용 프로그램은 크로마틴 리모델링 효소의 분석, 이중 자극을 통합 수정 된 EMSA, 세균 반응 조절기의 결합 사이트의 연구를 포함한다.
EMSA, 전기 이동성 이동 분석, 또한 젤 시프트 분석으로 알려진, 다재 다능하고 민감한 생화학 적 절차입니다. EMSA는 젤 전기포고증의 대역의 변화를 감지하여 단백질과 핵산 사이의 결합을 해명한다.
이 비디오는 EMSA의 원리에 대해 설명하고, 일반 절차를 제공하며, 일부 응용 프로그램에 대해 설명합니다.
DNA 복제, 전사 및 수리뿐만 아니라 RNA 처리는 모두 중요한 생화학 적 과정입니다. 그(것)들은 모두 단백질과 핵산 사이 결합을 관련시킵니다. 많은 심각한 질병 및 장애는이 바인딩의 수정과 관련이 있습니다. EMSA는 특정 단백질이 특정 핵산에 결합하는지 여부를 질적으로 결정하는 기술입니다. 첫째, 핵산은 일반적으로 방사성 인-32로 표지되어 프로브를 생성한다. 그런 다음 시험 단백질과 핵산 프로브가 혼합된다. 단백질이 핵산 프로브에 결합될 때, 결과 복합체는 핵산 단독으로더 큰 질량 및 다른 형성을 갖는다.
일단 결합되면, 복합체는 겔 전기전구로 분석됩니다. 이 기술에서 전기장은 거대 분자가 젤 매트릭스를 통해 이동하도록 강요합니다. 구성 요소는 질량, 충전 및 변형에 따라 분리됩니다. 전기 전구는 단백질 DNA 복합체를 결합되지 않은 프로브와 분리할 수 있습니다. 그들은 다른 질량과 순응을 가지고 있기 때문에, 그들은 다른 속도로 젤을 통해 마이그레이션하고 분리합니다. 분리는 방사성 인의 존재 덕분에 쉽게 검출되고, 단백질이 주어진 핵산에 성공적으로 결합한다는 것을 증명한다. 단백질의 식별을 확인하기 위해 "슈퍼 변속 분석"은 단백질에 알려진 친화력을 가진 항체를 사용합니다. 이것은 복잡한 을 더 이동하여 해상도를 증가시키는 추가이 있습니다.
이제 우리는 원리를 보았으니, 실험실에서 보자.
절차를 시작하려면 단백질을 분리해야합니다. 이렇게 하려면 분자 생물학 기술이 세포에서 단백질을 표현한 다음 정화하는 데 사용됩니다.
핵산은 증폭되고 프로브를 만들기 위하여 표지됩니다. 라벨링은 방사성 인-32를 포함하는 dCTP로 10분 동안 배양을 통해 수행됩니다. 방사능 안전 워크벤치와 보호 장비가 필요합니다.
젤은 다음 준비됩니다. 젤은 단백질이 변형을 변화시키지 못하게하고 전기 포근 중 프로브에서 잠재적으로 결합하지 않도록 비 데칭이 필요합니다. 폴리아크릴아미드 젤은 5~20nm의 모공 크기를 가지고 있으며 길이가 최대 100개의 기본 쌍을 단층프로브에 유용합니다. 아가로즈 젤은 70-700 nm의 모공 크기를 가지고 있으며 더 큰 프로브에 유용합니다.
단백질과 핵산 프로브가 준비되면서 결합을 진행합니다. TRIS 완충액이 준비되고 단백질과 프로브가 추가됩니다. pH는 비표적 핵산과의 약한 결합을 형성하는 단백질을 방지하기에 충분한 생리적 조건 및 소금 농도와 유사해야 한다. 반응은 4°C에서 20-30분 동안 진행됩니다.
다음 단계는 전기 전동입니다. 결합 반응에 사용되는 것과 유사한 낮은 이온 강도 및 pH의 완충제가 활용된다. 복합체를 안정시키고 이동성을 증가시키며 열 발생을 줄이는 "caging 효과"를 생성합니다. 전기 전도 후, 젤의 구성 요소는 필터 용지에 전달됩니다. 어두운 방에서 필터 용지가 필름에 노출됩니다. 단백질이 프로브에 결합하는 경우에, 2개의 뚜렷한 표지된 지구는 전송에서 보일 것입니다. 복합체를 나타내는 하나, 그리고 언바운드 프로브를 나타내는 별도의 프로브. 분리는 단백질이 핵산에 성공적으로 결합한다는 것을 보여줍니다.
이제 기본 절차를 살펴보셨으니 일부 응용 프로그램을 살펴보겠습니다.
크로마틴은 진핵세포를 발견한 DNA와 단백질의 단단히 포장된 복합체이다. 크로마틴 리모델링 효소는 DNA를 전사로 열어 구조를 수정합니다. 이 복합체의 이동성을 변경함에 따라 EMSA는 효소의 결합 활성을 탐구하는 데 사용할 수 있습니다.
라벨링에 대한 대체 접근법은 DNA와 메틸 트랜스퍼라제 효소 사이의 상호 작용을 활용합니다. 공동 요소는 메틸 트랜스퍼라아제(methyltransferase)를 통해 DNA에 영구적으로 결합하도록 수정될 수 있다. 인-32로 라벨을 붙이기보다는, 공동 요소는 방사성이 아니기 때문에 유리하게 비오틴에 공주됩니다. 공동 요소는 그것의 첨부 파일에서 사이트 특이적 이기 때문에, 그것은 유전자 인식, 메틸화 검출 및 유전자 납품과 관련이 있습니다. 비오티뉴클레스산은 자외선 형광을 통해 검출된다.
환경 자극이 히스티딘 키나아제 활성화되면 "응답 레귤레이터"가 인광됩니다. 이것은 차례로 EMSA에 의해 공부될 수 있는 전사에 영향을 미치는 DNA에 결합합니다. 예를 들면, Desulfovibrio 저속한에 있는 반응 레귤레이터는 관심있는 유전자에 결합하기 위하여 입증되었습니다. EMSA는 바인딩이 이루어졌는지 확인하는 데 사용되었습니다.
당신은 전기 전동 이동성 변화 분석에 JoVE의 비디오를 보았다. 이제 운영 원칙, 절차의 단계 및 주요 작동 매개 변수를 이해해야 합니다.
시청해 주셔서 감사합니다!
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이해 상충이 선언되지 않았습니다.
