Overview
Co-免疫沈降 (CoIP) プルダウン ・ アッセイは、安定したタンパク質間相互作用を識別するために密接に関連するメソッドです。これらのメソッドは、免疫沈降、抗体と結合した自由な蛋白質からターゲット蛋白質を分離する方法に関連しています。CoIP、抗体結合蛋白質は抗体と結合しない別の蛋白質にバインド自体、これはタンパク質タンパク質を保持する分離プロセスによって、続いて複雑な。プルダウンの試金の違いは餌の親和性タグ付きタンパク質を交換して、抗体、アフィニ ティー ・ クロマトグラフィー蛋白質蛋白質の複合体を分離するために使用します。
このビデオでは、CoIP、プルダウンの試金、および研究室での実装について説明します。試薬、装置、浄化し、バインドされた蛋白質を分析するために使用楽器など、各テクニックの手順プロトコルが覆われています。このビデオのアプリケーション セクションが myxovirus 蛋白質がインフルエンザ蛋白、プルダウンの試金および変更されたプルダウン法を介してカルモジュリンにおけるカルシウム イオンの役割の捜査を阻害する方法を研究するための手順をについて説明しますさらに、一時的な蛋白質の相互作用を特徴付けます。
蛋白質蛋白質の相互作用は、さまざまな生物学的機能に重要な役割を再生します。蛋白質蛋白質の相互作用とその生体影響の大半は、識別することまだあります。Co-免疫沈降、または CoIP、プルダウン ・ アッセイは、安定したタンパク質間相互作用を識別するための 2 つの密接に関連方法です。このビデオは、2 つの試金、一般的な検査手順、およびこれらの技術の応用の原理を説明します。
CoIP プルダウン ・ アッセイは、免疫沈降、複雑なソリューションからの蛋白質種を選択的に分離する方法のバリエーション。免疫沈降実験では、サンプルでそのターゲットと免疫複合体を形成する標的蛋白質への抗体となっています。複合体は、通常タンパク質セファローズ ビーズにバインドされている、固体のサポートにキャプチャされます。キャプチャされていない任意のタンパク質は、遠心分離の手順で削除されます。タンパク質は、SDS ページ サンプル読み込みバッファーを減らす沸騰によって抗体および固体のサポートから解放されます。
そのまま蛋白質複合体が固体のサポートにキャプチャされる点を除いて、Co 免疫沈降は同じ方法で行われています。抗体は、ターンでは、抗体のない対象となる別の蛋白質にバインドされているターゲット蛋白質にバインドします。免疫沈降のように蛋白質の複合体は SDS-PAGE サンプルバッファーの読み込みを減らす沸騰によって抗体と固体のサポートから解放されます。
プルダウン アッセイは、co-免疫沈降、抗体ではなく、「餌」蛋白質の使用でのみが異なるに似ています。分子生物学的手法によるこのタンパク質の餌は、ヒスチジンの残余のシリーズなどの親和性タグと設計されています。これらの親和性の札、「生体分子分離クロマトグラフィー ベース」で説明タンパク質は、固定化のアフィニティーリガンド タグのために特定のキャプチャされます。キャプチャされたタンパク質を「餌」と複合体を形成するタンパク質を含むサンプルでインキュベーションします。蛋白質の複合体は、「餌」タンパク質にタグの特定の競争力のある検体を含む溶液で洗浄することにより親和性サポートから解放されます。プルダウン アッセイは、co-免疫沈降によって予測された蛋白質の相互作用を確認するため、未知の蛋白質の相互作用を発見するために役立ちます。
Co 免疫沈降とプルダウン ・ アッセイの原理が説明されている、今は実験室プロシージャを見てみましょう。
最初 co 免疫沈降を説明しましょう。一連の microfuge の管の次の追加: PBS バッファー、および蛋白抗体に結合する樹脂タンパク質複合体、即ち 50% 溶液です。適切な配分を確保するため microfuge の管が回転して、追加の PBS バッファーで樹脂を洗浄するし。細胞ライセート、目的のタンパク質を含むと 2 μ g の抗体が microfuge の管に追加され、混合物は 4 ° C で 1 時間の回転遠心分離によってビーズをペレット、上清を捨て、ビーズ 3 回洗浄バッファーを非バインド タンパク質を削除して再。抗体蛋白質の複合体を含むビーズは、SDS ページ サンプル読み込みバッファー、抗体の複合体の除去、SDS-PAGE とイムノブロット解析を減らすことです。
今、プルダウンの試金のための手順について説明します:「餌」タンパク質は適切な親和性タグとプラスミドで表されます。ログ相成長を達した後セルを溶解し, して遠心し。「餌」タンパク質のビオチン タグをキャプチャ、中断されたストレプトアビジン セファローズ ビーズがおよび microfuge の管に戻します。ビーズは遠心し、上清を吸引により慎重に削除します。それから、ビーズはバッファー、遠心、上清除去と洗浄されます。
「餌」タンパク質の親和性を持っていると推定される「獲物」タンパク質を含むセルは、遠心分離によって収穫されています。上澄みは、樹脂を含むおよび microfuge の管に追加し、シェーカーで 3 h の 4 ° C で培養しました。樹脂は、遠心、上清除去し、樹脂非バインド蛋白質を取除くことを洗浄します。樹脂に溶出バッファーが追加され、混合物はシェーカー上で 30 分間室温でインキュベートします。樹脂は遠心し、目的の複合体を含む上清をイムノブロット分析します。
今では手順を確認しましたところ、co 免疫沈降法とプルダウン ・ アッセイの有用なアプリケーションのいくつかを見てみましょう。
Co 免疫沈降は、酵素の作用機序の理解を深めるに役立ちます。Myxovirus-、または Mx-の抵抗蛋白質を阻害メカニズムはよく理解されていないインフルエンザを含むウイルスの広い範囲。Co 免疫沈降は、マウス Mx1 タンパク質とインフルエンザ蛋白間相互作用の研究に使用されました。
プルダウンの試金は、携帯電話の環境からの信号を通信する蛋白質である第 2 メッセンジャーの効果の研究に役立っています。彼らは、複数のタンパク質が環境手がかりに応えて対話するシグナル伝達経路のコンポーネントです。カルシウム イオンは、多くの種類の生物学的反応を仲介するターンでは、さまざまなタンパク質に結合するカルモジュリンに結合して二次メッセンジャーとして機能します。せず、カルシウム、タンパク質は、カルモジュリンにバインドできません。
Co 免疫沈降法とプルダウンの試金は通常がない一時的なものの安定・強力な蛋白質の相互作用の分析に使用されます。HaloTag、プルダウン法の最近の発展は一時的な蛋白質の相互作用の研究を簡素化します。HaloTag 固体支持体ハロゲン化アルキルと反応して化学的にことができる興味の蛋白質に溶ける、遺伝子にコードされたタンパク質融合タグであります。蛋白質の複合体、そのままの状態で、タグ マイナスでしたそれから隔離する機能解析が必要な場合にたばこの孵化によってウイルスのプロテアーゼをエッチングします。
Co 免疫沈降とプルダウン ・ アッセイのゼウスのビデオを見てきただけ。このビデオは、2 つの方法、一般的な研究室プロシージャ、およびアプリケーションのいくつかの原則を説明します。
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