Overview
Co-immunoprécipitation (Pico) et menu déroulant dosages sont étroitement apparentées de méthodes pour identifier les interactions protéine-protéine stable. Ces méthodes sont liées à l’immunoprécipitation, une méthode pour séparer une protéine cible liée à un anticorps des protéines non liés. Pico, une protéine de liaison anticorps est liée à une autre protéine qui ne se lie pas avec l’anticorps, il est suivi par un processus de séparation qui préserve les protéines complexes. La différence dans les essais de la liste déroulante est que protéines d’affinité-tag appât remplacement anticorps et chromatographie d’affinité est utilisée pour isoler des complexes protéine-protéine.
Cette vidéo explique Pico, menu déroulant dosages et leur mise en œuvre dans le laboratoire. Un protocole étape par étape pour chaque technique est couvert, y compris les réactifs, les appareils et les instruments permettant de purifier et d’analyser les protéines liées. En outre, la section des applications de cette vidéo décrit une procédure pour étudier comment les protéines myxovirus inhibent la nucléoprotéine de grippe, une enquête sur le rôle des ions de calcium à la calmoduline via un menu déroulant dosage et d’un test mis à jour le menu déroulant pour caractériser les interactions entre protéines transitoires.
Interactions protéines-protéines jouent un rôle important dans une grande variété de fonctions biologiques. La plupart des interactions protéine-protéine et leurs effets biologiques doivent encore être identifiés. Co-Immunoprécipitation, ou Pico et menu déroulant dosages sont deux méthodes apparentées pour l’identification des interactions protéine-protéine stable. Cette vidéo couvre les principes des deux essais, leurs procédures générales de laboratoire et les applications de ces techniques.
Pico et menu déroulant dosages sont des variantes d’immunoprécipitation, une méthode pour isoler sélectivement une espèce de protéine d’une solution complexe. Dans une expérience d’immunoprécipitation, un anticorps spécifique d’une protéine cible est autorisé pour former un complexe immun avec cet objectif dans l’échantillon. Le complexe est ensuite capturé sur un support solide, généralement la protéine une limite d’une bille de Sépharose. Aucune protéine ne pas capturées est éliminées par étapes de centrifugation. La protéine est ensuite libérée de l’anticorps et le support solide en faisant bouillir dans la réduction de tampon de chargement d’échantillons SDS-PAGE.
Co-immunoprécipitation est réalisée de la même façon, sauf que les complexes de protéine intacte sont capturés sur le support solide. L’anticorps se lie à la protéine cible qui, à son tour, est liée à une autre protéine qui n’est pas ciblée par l’anticorps. Comme dans l’immunoprécipitation, le complexe protéique est libéré de l’anticorps et le support solide en portant à ébullition pour réduire la mémoire tampon échantillon de chargement SDS-PAGE.
Menu déroulant essais sont similaires aux co-immunoprécipitation, ne différant que par l’utilisation d’une protéine « appât », par opposition à un anticorps. Par le biais de techniques de biologie moléculaire, cette protéine appât est conçue avec une balise d’affinité, comme une série de résidus histidine. Ces balises d’affinité sont décrites dans « axée sur la chromatographie des séparations de biomolécule ». La protéine est ensuite capturée sur un ligand immobilisé affinité spécifique pour la balise. La protéine capturée est ensuite incubée auprès d’un échantillon qui contient des protéines qui forment des complexes avec le « appât ». Le complexe protéique est libéré de la prise en charge de l’affinité de lavage avec une solution contenant un spécifique de l’analyte compétitif pour la balise sur la protéine « appât ». Menu déroulant dosages sont utiles afin de confirmer les interactions protéine prédites par co-immunoprécipitation et pour découvrir les interactions de protéine inconnue.
Maintenant que les principes de co-immunoprécipitation et menu déroulant dosages ont été discutées, regardons leurs procédures de laboratoire.
Première nous allons discuter de co-immunoprécipitation. À une série de microtubes, le texte suivant est ajouté : tampon PBS et une solution de 50 % de protéine A-Sépharose, un complexe de résine-protéine qui se lie à l’anticorps. Les microtubes sont tournées pour assurer la distribution correcte, et puis la résine est lavée avec tampon PBS supplémentaire. Cellule lysat, contenant la protéine désirée et 2 μg d’anticorps sont ajoutés aux microtubes et le mélange est tourné pendant 1 h à 4 ° C. Les perles sont granulées par centrifugation, le surnageant est jeté et les perles re-laver trois fois avec le tampon à supprimer non lié aux protéines. Les perles contenant le complexe protéine-anticorps sont dans la réduction de tampon de chargement d’échantillons SDS-PAGE, pour enlèvement du complexe de l’anticorps et analyse par SDS-PAGE et immunoblotting.
Maintenant, nous allons discuter de la procédure pour des dosages de menu déroulant : la protéine « appât » s’exprime dans un plasmide avec la balise appropriée d’affinité. Après avoir atteint la croissance phase logarithmique, les cellules sont lysées et puis centrifugés. Streptavidine-Sépharose suspension perles, qui capturent de protéine de biotine-étiquetée « appât », sont distribués dans un tube à centrifuger. Les perles sont ensuite centrifugés et le surnageant sera enlevé par aspiration. Les perles sont ensuite lavées avec tampon, centrifugé et le surnageant supprimé.
Les cellules contenant la protéine putative de « proie », qui a une affinité pour la protéine « appât », sont récoltées par centrifugation. Le surnageant est ensuite ajouté à du tube à centrifuger contenant de la résine et incubé à 4 ° C pendant 3 h sur un agitateur. La résine est ensuite centrifugé, le surnageant supprimé, et la résine lavé pour enlever non lié aux protéines. Tampon d’élution est ajouté à la résine, et le mélange est incubé à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur. La résine est ensuite centrifugée et le surnageant contenant le complexe désiré est analysé par immunoblotting.
Maintenant que nous avons passé en revue les procédures, nous allons étudier certaines applications utiles de co-immunoprécipitation et dosages de menu déroulant.
Co-Immunoprécipitation peut être utile dans la compréhension des mécanismes des enzymes d’action. Protéines de résistance Myxovirus ou Mx-, inhibent un large éventail de virus, y compris la grippe A, dont le mécanisme est mal compris. Co-Immunoprécipitation a été utilisé pour étudier l’interaction entre la souris protéine Mx1 et la nucléoprotéine grippe.
Menu déroulant dosages sont avérés utiles pour étudier les effets de seconds messagers, qui sont des protéines qui communiquent un signal provenant de l’environnement cellulaire. Elles constituent un élément d’une voie de signalisation où plusieurs protéines interagissent en réponse à des stimuli environnementaux. Les ions calcium agissent comme des messagers secondaires en se liant à la calmoduline, qui, à son tour, se lie à une grande variété de protéines, médiation de nombreux types de réponses biologiques. Sans le calcium, la protéine ne peut pas lier à la calmoduline.
Co-Immunoprécipitation et menu déroulant dosages sont généralement utilisés pour l’analyse des interactions de protéine stable ou forte, mais pas transitoire. Un développement récent dans le menu déroulant dosages, la HaloTag, a simplifié l’étude des interactions entre protéines transitoires ; HaloTag est une balise de fusion de protéine codée génétiquement, fondue à la protéine d’intérêt, capable de réagir chimiquement avec un support solide haloalcanes. Si vous souhaitez l’analyse fonctionnelle, la protéine complexe, moins l’étiquette, dans son intégralité pourrait alors être isolée en incubant avec tabac etch protéase du virus.
Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE co-immunoprécipitation et dosages de menu déroulant. Cette vidéo décrit les principes de deux méthodes, les procédures générales de laboratoire et certaines de leurs applications.
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