Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Biochemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

שיתוף פעולה עם אימונופרפיטציה וביטולי נסיגה
 
Click here for the English version

שיתוף פעולה עם אימונופרפיטציה וביטולי נסיגה

Overview

אימונופרציפיטציה משותפת (CoIP) ובוחות ישבן מושכות למטה הן שיטות קשורות קשר הדוק לזיהוי אינטראקציות יציבות בין חלבון חלבון. שיטות אלה קשורות אימונופרפיציטציה, שיטה להפרדת חלבון יעד הקשור לנוגדן מחלבונים לא מאוגדים. ב- CoIP, חלבון הקשור לנוגדנים קשור בעצמו לחלבון אחר שאינו נקשר לנוגדן, ואחריו תהליך הפרדה המשמר את קומפלקס חלבון החלבון. ההבדל בבחינת מטה הוא שחלבוני פיתיון מתויגים זיקה מחליפים נוגדנים, וכרומטוגרפיה של זיקה משמשת לבידוד תסביבי חלבון חלבון.

וידאו זה מסביר CoIP, משיכה למטה assays, ואת היישום שלהם במעבדה. פרוטוקול שלב אחר שלב עבור כל טכניקה מכוסה, כולל ריאגנטים, מכשירים ומכשירים המשמשים לטיהור וניתוח חלבונים קשורים. בנוסף, סעיף היישומים של וידאו זה מתאר הליך כדי לחקור כיצד חלבונים myxovirus לעכב נוקלאופרוטאין שפעת, חקירה לתוך התפקיד של יוני סידן ב calmodulin באמצעות בדיקה למטה, ובדיקה מושכת למטה שונה לאפיון אינטראקציות חלבון חולף.

אינטראקציות חלבון-חלבון לשחק תפקיד משמעותי במגוון רחב של פונקציות ביולוגיות. רוב האינטראקציות בין חלבון לחלבון והשפעותיהם הביולוגיות טרם זוהו. שיתוף אימונופרציפיטציה, או CoIP, וביטולים מושכים למטה הן שתי שיטות הקשורות קשר הדוק לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון יציבות. וידאו זה יכסה את העקרונות של שני מבאי, נהלי המעבדה הכלליים שלהם, ויישומים של טכניקות אלה.

CoIP ובדיקות מושכות למטה הן גרסאות של אימונופרציפיטציה, שיטה לבידוד סלקטיבי של מיני חלבון מתמיסה מורכבת. בניסוי אימונופרציפיטציה, נוגדן ספציפי לחלבון מטרה רשאי ליצור קומפלקס חיסוני עם מטרה זו במדגם. לאחר מכן, המתחם נלכד על תמיכה מוצקה, בדרך כלל חלבון A קשור חרוז ספרוז. כל החלבונים שלא נלכדו מוסרים על ידי שלבי צנטריפוגה. לאחר מכן החלבון משתחרר מהנוגדנים והתמיכה המוצקה על ידי רתיחה בהפחתת מאגר טעינת הדגימה של SDS-PAGE.

אימונופרציפיטציה משותפת מתבצעת באותו אופן, אלא שתומכי חלבון שלמים נלכדים על התמיכה המוצקה. הנוגדן נקשר לחלבון היעד, אשר, בתורו, קשור לחלבון אחר שאינו ממוקד על ידי הנוגדן. כמו אימונופרציפיטציה, קומפלקס החלבון משתחרר מהנוגדנים ותמיכה מוצקה על ידי רתיחה בהפחתת מאגר טעינת דגימת SDS-PAGE.

בדיקות משוך כלפי מטה דומות ל-co-immunoprecipitation, שונות רק בשימוש בחלבון "פיתיון", בניגוד לנוגדן. באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית, חלבון פיתיון זה מהונדס עם תג זיקה, כגון סדרה של שאריות היסטידין. תגי זיקה אלה מתוארים ב"הפרדות ביומולקוליות מבוססות כרומטוגרפיה". לאחר מכן החלבון נלכד על ליגנד זיקה משותק ספציפי לתג. לאחר מכן דגירה החלבון שנתפס עם מדגם המכיל חלבונים היוצרים קומפלקסים עם "הפיתיון". קומפלקס החלבון משתחרר מתמיכת הזיקה על ידי כביסה עם פתרון המכיל ניתוח תחרותי ספציפי לתג על חלבון "הפיתיון". גישרושים שימושיים לאישור אינטראקציות חלבון שנחזו על ידי אימונופרציפיטציה משותפת, ולגילוי אינטראקציות חלבון לא ידועות.

עכשיו, לאחר שנדונו העקרונות של אימונופרפיטציה משותפת ובדיחות נסיגה, בואו נסתכל על נהלי המעבדה שלהם.

ראשית, בואו נדבר על אימונופרציפיטציה משותפת. לסדרה של צינורות מיקרו-פוגה מתווספים: חוצץ PBS, ופתרון של 50% חלבון A-ספרוז, קומפלקס חלבון שרף שנקשר לנוגדן. צינורות המיקרו-פוגה מסובבים כדי להבטיח הפצה נכונה, ואז השרף נשטף עם חוצץ PBS נוסף. ליסאט התא, המכיל את החלבון הרצוי, ו 2 מיקרוגרם של נוגדן מתווספים צינורות microfuge, ואת התערובת מסובבת במשך 1 שעות ב 4 °C (70 °F). החרוזים מגולפים על ידי צנטריפוגה, הסופר-נט מושלך, והחרוזים נשטפו מחדש שלוש פעמים עם חוצץ כדי להסיר חלבון שאינו קשור. החרוזים המכילים את קומפלקס הנוגדנים-חלבון נמצאים בהפחתת מאגר טעינת הדגימה SDS-PAGE, להסרת המתחם מהנוגדן ולניתוח על ידי SDS-PAGE וחיסון.

עכשיו נדון בהליך לבדיקות משוך למטה: חלבון "הפיתיון" בא לידי ביטוי בפלסטיד עם תג הזיקה המתאים. לאחר הגעה לצמיחה בשלב יומן הרישום, התאים הם lysed, ולאחר מכן צנטריפוגה. חרוזי סטרפטווידין-ספרוז מושעים, הלוכדים חלבון "פיתיון" מתויג ביוטין, מועברים לצינור מיקרו-פאג'. לאחר מכן החרוזים הם צנטריפוגות ואת supernatant הוסר בזהירות על ידי שאיפה. לאחר מכן, החרוזים נשטפים עם חוצץ, צנטריפוגה, ואת supernatant הוסר.

תאים המכילים את חלבון "הטרף" putative, אשר יש זיקה לחלבון "פיתיון", נקצרים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, הסופר-נט מתווסף לצינור המיקרו-פוגה המכיל את השרף, ודורג ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות על שייקר. לאחר מכן, השרף הוא צנטריפוגה, הסופר-טבעי הוסר, והשרף נשטף כדי להסיר חלבון שאינו קשור. חוצץ Elution מתווסף שרף, ואת התערובת הוא דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות על שייקר. לאחר מכן, השרף הוא צנטריפוגה, ואת supernatant המכיל את המתחם הרצוי מנותח על ידי אימונובלוטלינג.

עכשיו שבדקנו את הנהלים, בואו נסתכל על כמה מהיישומים השימושיים של אימונופרנציה משותפת ובדיקות נסיגה.

שיתוף immunoprecipitation יכול להיות שימושי בהבנה טובה יותר של מנגנון הפעולה של אנזימים. Myxovirus-, או Mx-, חלבוני התנגדות לעכב מגוון רחב של וירוסים, כולל שפעת A, אשר המנגנון הוא מובן היטב. Co-immunoprecipitation שימש כדי ללמוד את האינטראקציה בין חלבון Mx1 העכבר ונוקלאופרוטאין שפעת.

בדיקות משוך למטה הוכיחו שימושי בחקר ההשפעות של שליחים שניים, שהם חלבונים המתקשרים אות מהסביבה התאית. הם מרכיב של מסלול איתות שבו חלבונים מרובים אינטראקציה בתגובה רמזים סביבתיים. יוני סידן פועלים כשליחים משניים על ידי קשירה ל- calmodulin, אשר, בתורו, נקשר למגוון רחב של חלבונים, בתיווך סוגים רבים של תגובות ביולוגיות. בלי הסידן, החלבון לא יכול להיקשר לקלמולין. בדיקה משוך למטה נערך כדי לבדוק את היכולת של חלבונים להיקשר calmodulin בנוכחות או היעדר יוני סידן.

שיתוף אימונופרציפיטציה וביטולים נמשכים משמשים בדרך כלל לניתוח אינטראקציות חלבון יציבות או חזקות, אך לא חולפות. התפתחות אחרונה בהתקפות מושכות למטה, HaloTag, פישטה את המחקר של אינטראקציות חלבון חולפות; HaloTag הוא תג היתוך חלבון מקודד גנטית, מותך לחלבון בעל עניין, המסוגל להגיב כימית עם תמיכה מוצקה haloalkane. אם נדרש ניתוח פונקציונלי, קומפלקס החלבון, מינוס התג, בשלמותו יכול להיות מבודד על ידי דגירה עם פרוטאז וירוס חרט חרטה טבק.

הרגע צפית בסרטון של ג'וב על אימונופרפיטציה משותפת ובבדיקים מושכים למטה. סרטון זה תיאר את עקרונות שתי השיטות, את נהלי המעבדה הכלליים וחלק מהיישומים שלהם.

תודה שצפיתם!

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אימונופרציפיטציה משותפת (CoIP) ובוחות ישבן מושכות למטה הן שיטות קשורות קשר הדוק לזיהוי אינטראקציות יציבות בין חלבון חלבון. שיטות אלה קשורות אימונופרפיציטציה, שיטה להפרדת חלבון יעד הקשור לנוגדן מחלבונים לא מאוגדים. ב- CoIP, חלבון הקשור לנוגדנים קשור בעצמו לחלבון אחר שאינו נקשר לנוגדן, ואחריו תהליך הפרדה המשמר את קומפלקס חלבון החלבון. ההבדל בבחינת מטה הוא שחלבוני פיתיון מתויגים זיקה מחליפים נוגדנים, וכרומטוגרפיה של זיקה משמשת לבידוד תסביבי חלבון חלבון.

וידאו זה מסביר CoIP, משיכה למטה assays, ואת היישום שלהם במעבדה. פרוטוקול שלב אחר שלב עבור כל טכניקה מכוסה, כולל ריאגנטים, מכשירים ומכשירים המשמשים לטיהור וניתוח חלבונים קשורים. בנוסף, סעיף היישומים של וידאו זה מתאר הליך כדי לחקור כיצד חלבונים myxovirus לעכב נוקלאופרוטאין שפעת, חקירה לתוך התפקיד של יוני סידן ב calmodulin באמצעות בדיקה למטה, ובדיקה מושכת למטה שונה לאפיון אינטראקציות חלבון חולף.

אינטראקציות חלבון-חלבון לשחק תפקיד משמעותי במגוון רחב של פונקציות ביולוגיות. רוב האינטראקציות בין חלבון לחלבון והשפעותיהם הביולוגיות טרם זוהו. שיתוף אימונופרציפיטציה, או CoIP, וביטולים מושכים למטה הן שתי שיטות הקשורות קשר הדוק לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון יציבות. וידאו זה יכסה את העקרונות של שני מבאי, נהלי המעבדה הכלליים שלהם, ויישומים של טכניקות אלה.

CoIP ובדיקות מושכות למטה הן גרסאות של אימונופרציפיטציה, שיטה לבידוד סלקטיבי של מיני חלבון מתמיסה מורכבת. בניסוי אימונופרציפיטציה, נוגדן ספציפי לחלבון מטרה רשאי ליצור קומפלקס חיסוני עם מטרה זו במדגם. לאחר מכן, המתחם נלכד על תמיכה מוצקה, בדרך כלל חלבון A קשור חרוז ספרוז. כל החלבונים שלא נלכדו מוסרים על ידי שלבי צנטריפוגה. לאחר מכן החלבון משתחרר מהנוגדנים והתמיכה המוצקה על ידי רתיחה בהפחתת מאגר טעינת הדגימה של SDS-PAGE.

אימונופרציפיטציה משותפת מתבצעת באותו אופן, אלא שתומכי חלבון שלמים נלכדים על התמיכה המוצקה. הנוגדן נקשר לחלבון היעד, אשר, בתורו, קשור לחלבון אחר שאינו ממוקד על ידי הנוגדן. כמו אימונופרציפיטציה, קומפלקס החלבון משתחרר מהנוגדנים ותמיכה מוצקה על ידי רתיחה בהפחתת מאגר טעינת דגימת SDS-PAGE.

בדיקות משוך כלפי מטה דומות ל-co-immunoprecipitation, שונות רק בשימוש בחלבון "פיתיון", בניגוד לנוגדן. באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית, חלבון פיתיון זה מהונדס עם תג זיקה, כגון סדרה של שאריות היסטידין. תגי זיקה אלה מתוארים ב"הפרדות ביומולקוליות מבוססות כרומטוגרפיה". לאחר מכן החלבון נלכד על ליגנד זיקה משותק ספציפי לתג. לאחר מכן דגירה החלבון שנתפס עם מדגם המכיל חלבונים היוצרים קומפלקסים עם "הפיתיון". קומפלקס החלבון משתחרר מתמיכת הזיקה על ידי כביסה עם פתרון המכיל ניתוח תחרותי ספציפי לתג על חלבון "הפיתיון". גישרושים שימושיים לאישור אינטראקציות חלבון שנחזו על ידי אימונופרציפיטציה משותפת, ולגילוי אינטראקציות חלבון לא ידועות.

עכשיו, לאחר שנדונו העקרונות של אימונופרפיטציה משותפת ובדיחות נסיגה, בואו נסתכל על נהלי המעבדה שלהם.

ראשית, בואו נדבר על אימונופרציפיטציה משותפת. לסדרה של צינורות מיקרו-פוגה מתווספים: חוצץ PBS, ופתרון של 50% חלבון A-ספרוז, קומפלקס חלבון שרף שנקשר לנוגדן. צינורות המיקרו-פוגה מסובבים כדי להבטיח הפצה נכונה, ואז השרף נשטף עם חוצץ PBS נוסף. ליסאט התא, המכיל את החלבון הרצוי, ו 2 מיקרוגרם של נוגדן מתווספים צינורות microfuge, ואת התערובת מסובבת במשך 1 שעות ב 4 °C (70 °F). החרוזים מגולפים על ידי צנטריפוגה, הסופר-נט מושלך, והחרוזים נשטפו מחדש שלוש פעמים עם חוצץ כדי להסיר חלבון שאינו קשור. החרוזים המכילים את קומפלקס הנוגדנים-חלבון נמצאים בהפחתת מאגר טעינת הדגימה SDS-PAGE, להסרת המתחם מהנוגדן ולניתוח על ידי SDS-PAGE וחיסון.

עכשיו נדון בהליך לבדיקות משוך למטה: חלבון "הפיתיון" בא לידי ביטוי בפלסטיד עם תג הזיקה המתאים. לאחר הגעה לצמיחה בשלב יומן הרישום, התאים הם lysed, ולאחר מכן צנטריפוגה. חרוזי סטרפטווידין-ספרוז מושעים, הלוכדים חלבון "פיתיון" מתויג ביוטין, מועברים לצינור מיקרו-פאג'. לאחר מכן החרוזים הם צנטריפוגות ואת supernatant הוסר בזהירות על ידי שאיפה. לאחר מכן, החרוזים נשטפים עם חוצץ, צנטריפוגה, ואת supernatant הוסר.

תאים המכילים את חלבון "הטרף" putative, אשר יש זיקה לחלבון "פיתיון", נקצרים על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, הסופר-נט מתווסף לצינור המיקרו-פוגה המכיל את השרף, ודורג ב-4 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות על שייקר. לאחר מכן, השרף הוא צנטריפוגה, הסופר-טבעי הוסר, והשרף נשטף כדי להסיר חלבון שאינו קשור. חוצץ Elution מתווסף שרף, ואת התערובת הוא דגירה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות על שייקר. לאחר מכן, השרף הוא צנטריפוגה, ואת supernatant המכיל את המתחם הרצוי מנותח על ידי אימונובלוטלינג.

עכשיו שבדקנו את הנהלים, בואו נסתכל על כמה מהיישומים השימושיים של אימונופרנציה משותפת ובדיקות נסיגה.

שיתוף immunoprecipitation יכול להיות שימושי בהבנה טובה יותר של מנגנון הפעולה של אנזימים. Myxovirus-, או Mx-, חלבוני התנגדות לעכב מגוון רחב של וירוסים, כולל שפעת A, אשר המנגנון הוא מובן היטב. Co-immunoprecipitation שימש כדי ללמוד את האינטראקציה בין חלבון Mx1 העכבר ונוקלאופרוטאין שפעת.

בדיקות משוך למטה הוכיחו שימושי בחקר ההשפעות של שליחים שניים, שהם חלבונים המתקשרים אות מהסביבה התאית. הם מרכיב של מסלול איתות שבו חלבונים מרובים אינטראקציה בתגובה רמזים סביבתיים. יוני סידן פועלים כשליחים משניים על ידי קשירה ל- calmodulin, אשר, בתורו, נקשר למגוון רחב של חלבונים, בתיווך סוגים רבים של תגובות ביולוגיות. בלי הסידן, החלבון לא יכול להיקשר לקלמולין. בדיקה משוך למטה נערך כדי לבדוק את היכולת של חלבונים להיקשר calmodulin בנוכחות או היעדר יוני סידן.

שיתוף אימונופרציפיטציה וביטולים נמשכים משמשים בדרך כלל לניתוח אינטראקציות חלבון יציבות או חזקות, אך לא חולפות. התפתחות אחרונה בהתקפות מושכות למטה, HaloTag, פישטה את המחקר של אינטראקציות חלבון חולפות; HaloTag הוא תג היתוך חלבון מקודד גנטית, מותך לחלבון בעל עניין, המסוגל להגיב כימית עם תמיכה מוצקה haloalkane. אם נדרש ניתוח פונקציונלי, קומפלקס החלבון, מינוס התג, בשלמותו יכול להיות מבודד על ידי דגירה עם פרוטאז וירוס חרט חרטה טבק.

הרגע צפית בסרטון של ג'וב על אימונופרפיטציה משותפת ובבדיקים מושכים למטה. סרטון זה תיאר את עקרונות שתי השיטות, את נהלי המעבדה הכלליים וחלק מהיישומים שלהם.

תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter