Overview
공동 면역 침전 (CoIP) 및 풀다운 분석은 안정적인 단백질 단백질 상호 작용을 식별하는 밀접하게 관련된 방법입니다. 이러한 방법은 면역 침전과 관련이 있으며, 이는 결합되지 않은 단백질로부터 항체에 결합된 표적 단백질을 분리하는 방법이다. CoIP에서, 항체 결합 단백질 자체는 항체와 결합하지 않는 다른 단백질에 묶여 있으며, 이것은 단백질-단백질 복합체를 보존하는 분리 과정에 선행된다. 풀다운 에세이의 차이점은 선호도 태그가 달린 미끼 단백질이 항체를 대체하고 친화 성 염색체가 단백질 단백질 복합체를 분리하는 데 사용된다는 것입니다.
이 비디오는 CoIP, 풀다운 에세이 및 실험실에서의 구현에 대해 설명합니다. 결합된 단백질을 정화하고 분석하는 데 사용되는 시약, 장치 및 계측기를 포함하여 각 기술에 대한 단계별 프로토콜이 적용됩니다. 또한, 이 비디오의 적용 섹션은 myxovirus 단백질이 인플루엔자 뉴클레오단백질을 억제하는 방법, 풀다운 분석법을 통해 칼모둘린에서 칼슘 이온의 역할에 대한 조사, 과도 단백질 상호 작용을 특성화하기 위한 수정된 풀다운 분석 등을 연구하는 절차를 설명합니다.
단백질 단백질 상호 작용은 다양한 생물학적 기능에 중요한 역할을 합니다. 단백질 단백질 상호 작용의 대다수 및 그들의 생물학 효력은 아직 확인되지 않았습니다. 공존면역침전, 또는 CoIP, 및 풀다운 분석법은 안정적인 단백질-단백질 상호작용을 식별하기 위한 두 가지 밀접한 관련 방법이다. 이 비디오는 두 가지 에세이의 원칙, 일반적인 실험실 절차 및 이러한 기술의 응용 프로그램을 다룹니다.
CoIP 및 풀다운 분석법은 면역 침전의 이체이며, 복잡한 용액으로부터 단백질 종을 선택적으로 격리시키는 방법입니다. 면역 침전 실험에서, 표적 단백질에 특이적인 항체는 시료에 있는 그 표적으로 면역 복합체를 형성하는 것이 허용됩니다. 복합체는 고체 지지대에서 포획되고, 전형적으로 단백질 A는 세파로즈 비드에 묶여 있다. 포획되지 않은 모든 단백질은 원심분리 단계에 의해 제거됩니다. 단백질은 SDS-PAGE 시료 로딩 버퍼를 감소시키는 데 끓여 서 항체 및 고체 지지에서 방출된다.
동면역침전은 그대로 단백질 복합체가 고체 지지에 포획된다는 점을 제외하고는 동일한 방식으로 수행된다. 항체는 표적 단백질에 결합하며, 이는 차례로 항체에 의해 표적화되지 않은 다른 단백질에 결합된다. 면역 침전에서와 같이, 단백질 복합체는 SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼를 감소시키는 끓임으로써 항체 및 고체 지지로부터 방출된다.
풀다운 분석체는 항체와 는 달리 "미끼" 단백질의 사용에서만 다른 공동 면역 침전과 유사합니다. 분자 생물학 기술을 통해 이 미끼 단백질은 일련의 히스티딘 잔류물과 같은 친화성 태그로 설계되었습니다. 이러한 친화성 태그는 "크로마토그래피 기반 생체 분자 분리"에 설명되어 있습니다. 단백질은 태그에 특정 고정 된 친화성 리간드에 캡처됩니다. 그 때 붙잡힌 단백질은 "미끼"로 복합체를 형성하는 단백질을 포함하는 견본으로 인큐베이션됩니다. 단백질 복합체는 "미끼" 단백질에 대한 태그에 특이적인 경쟁적인 별립을 포함하는 용액으로 세척함으로써 친화성 지원으로부터 방출된다. 풀다운 분석은 공동 면역 강수량에 의해 예측된 단백질 상호 작용을 확인하고, 알려지지 않은 단백질 상호 작용을 발견하는 데 유용합니다.
이제 공동 면역 강수량 및 풀다운 분석의 원리가 논의되었으므로 실험실 절차를 살펴 보겠습니다.
먼저 공동 면역 침전을 논의해 봅시다. 일련의 마이크로퍼지 튜브에, PBS 버퍼, 및 항체에 결합하는 수지 단백질 복합체인 단백질 A-sepharose의 50% 용액이 추가된다. 미세 분리 튜브는 적절한 분포를 보장하기 위해 회전한 다음 수지를 추가 PBS 버퍼로 세척합니다. 세포 용액, 원하는 단백질을 함유하고, 항체의 2 μg가 마이크로퍼지 튜브에 첨가되고, 혼합물은 4°C에서 1시간 동안 회전된다. 구슬은 원심분리에 의해 펠릿화되고, 상류체는 폐기되고, 비결합 단백질을 제거하기 위해 완충제로 세 번 재세척된다. 항체-단백질 복합체를 함유하는 구슬은 SDS-PAGE 시료 로딩 버퍼를 감소시키고, 항체로부터 복합체를 제거하고 SDS-PAGE 및 면역블로팅에 의한 분석을 위한 것이다.
이제 우리는 풀다운 에세이에 대한 절차를 논의 할 것이다 : "미끼"단백질은 적절한 친화성 태그와 플라스미드로 표현된다. 로그 상 성장에 도달 한 후, 세포는 lysed, 다음 원심 분리. 비틴 태그가 붙은 "미끼" 단백질을 포착하는 염혈막-세파로즈 구슬은 마이크로퍼지 튜브로 피펫처리됩니다. 구슬은 원심 분리되고 상부는 포부에 의해 조심스럽게 제거됩니다. 그런 다음 구슬을 버퍼, 원심 분리 및 상부제거로 세척합니다.
"미끼" 단백질에 대한 친화력을 가한 putative "prey" 단백질을 함유한 세포는 원심분리에 의해 수확됩니다. 상피체는 수지를 포함하는 마이크로퍼지 튜브에 첨가되고, 셰이커에서 3시간 동안 4°C에서 배양한다. 수지는 원심 분리되고, 상피가 제거되고, 수지는 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 세척됩니다. 용출 버퍼는 수지에 첨가되고, 혼합물은 셰이커에 30 분 동안 실온에서 배양된다. 수지는 원심분리되고, 원하는 복합체를 포함하는 상피제는 면역블로팅에 의해 분석된다.
이제 절차를 검토한 결과, 공동 면역 침전 및 풀다운 분석의 유용한 응용 분야 중 일부를 살펴보겠습니다.
공동 면역 침전은 효소의 작용 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 유용할 수 있습니다. Myxovirus-또는 Mx-, 내성 단백질은 기전이 제대로 이해되지 않는 인플루엔자 A를 포함한 광범위한 바이러스를 억제합니다. 공존성전성은 마우스 Mx1 단백질과 인플루엔자 뉴클레오단백질 간의 상호작용을 연구하기 위해 사용되었다.
풀다운 분석에는 세포 환경으로부터 신호를 전달하는 단백질인 두 번째 메신저의 효과를 연구하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다. 그(것)들은 다중 단백질이 환경 단서에 응하여 상호 작용하는 신호 통로의 분대입니다. 칼슘 이온은 칼모둘린에 결합하여 이차 메신저 역할을 하며, 이는 다양한 단백질에 결합하여 많은 유형의 생물학적 반응을 중재합니다. 칼슘이 없으면 단백질은 칼모둘린에 결합할 수 없습니다. 탈당 분석법은 칼슘 이온의 존재 또는 부재에서 칼모둘린에 결합하는 단백질의 능력을 테스트하기 위하여 실시되었습니다.
공동 면역 침전 및 풀다운 분석은 일반적으로 안정적이거나 강한 단백질 상호 작용을 분석하는 데 사용되지만 일시적인 분석은 아닙니다. 풀다운 에세이의 최근 개발, HaloTag, 일시적인 단백질 상호 작용의 연구를 단순화했다; HaloTag는 유전적으로 인코딩된 단백질 융합 태그로, 관심 있는 단백질에 융합되어 할랄카 고체 지지체로 화학적으로 반응할 수 있습니다. 기능적 분석이 바람직한 경우, 단백질 복합체는 태그를 뺀 다음 담배 에칭 바이러스 프로테아제로 인큐베이팅하여 격리될 수 있습니다.
당신은 단지 공동 면역 침전 및 풀다운 분석에 JoVE의 비디오를 보았다. 이 비디오는 두 가지 방법의 원리, 일반 실험실 절차 및 일부 응용 분야에 대해 설명했습니다.
시청해 주셔서 감사합니다!
Procedure
공동 면역 침전 (CoIP) 및 풀다운 분석은 안정적인 단백질 단백질 상호 작용을 식별하는 밀접하게 관련된 방법입니다. 이러한 방법은 면역 침전과 관련이 있으며, 이는 결합되지 않은 단백질로부터 항체에 결합된 표적 단백질을 분리하는 방법이다. CoIP에서, 항체 결합 단백질 자체는 항체와 결합하지 않는 다른 단백질에 묶여 있으며, 이것은 단백질-단백질 복합체를 보존하는 분리 과정에 선행된다. 풀다운 에세이의 차이점은 선호도 태그가 달린 미끼 단백질이 항체를 대체하고 친화 성 염색체가 단백질 단백질 복합체를 분리하는 데 사용된다는 것입니다.
이 비디오는 CoIP, 풀다운 에세이 및 실험실에서의 구현에 대해 설명합니다. 결합된 단백질을 정화하고 분석하는 데 사용되는 시약, 장치 및 계측기를 포함하여 각 기술에 대한 단계별 프로토콜이 적용됩니다. 또한, 이 비디오의 적용 섹션은 myxovirus 단백질이 인플루엔자 뉴클레오단백질을 억제하는 방법, 풀다운 분석법을 통해 칼모둘린에서 칼슘 이온의 역할에 대한 조사, 과도 단백질 상호 작용을 특성화하기 위한 수정된 풀다운 분석 등을 연구하는 절차를 설명합니다.
단백질 단백질 상호 작용은 다양한 생물학적 기능에 중요한 역할을 합니다. 단백질 단백질 상호 작용의 대다수 및 그들의 생물학 효력은 아직 확인되지 않았습니다. 공존면역침전, 또는 CoIP, 및 풀다운 분석법은 안정적인 단백질-단백질 상호작용을 식별하기 위한 두 가지 밀접한 관련 방법이다. 이 비디오는 두 가지 에세이의 원칙, 일반적인 실험실 절차 및 이러한 기술의 응용 프로그램을 다룹니다.
CoIP 및 풀다운 분석법은 면역 침전의 이체이며, 복잡한 용액으로부터 단백질 종을 선택적으로 격리시키는 방법입니다. 면역 침전 실험에서, 표적 단백질에 특이적인 항체는 시료에 있는 그 표적으로 면역 복합체를 형성하는 것이 허용됩니다. 복합체는 고체 지지대에서 포획되고, 전형적으로 단백질 A는 세파로즈 비드에 묶여 있다. 포획되지 않은 모든 단백질은 원심분리 단계에 의해 제거됩니다. 단백질은 SDS-PAGE 시료 로딩 버퍼를 감소시키는 데 끓여 서 항체 및 고체 지지에서 방출된다.
동면역침전은 그대로 단백질 복합체가 고체 지지에 포획된다는 점을 제외하고는 동일한 방식으로 수행된다. 항체는 표적 단백질에 결합하며, 이는 차례로 항체에 의해 표적화되지 않은 다른 단백질에 결합된다. 면역 침전에서와 같이, 단백질 복합체는 SDS-PAGE 샘플 로딩 버퍼를 감소시키는 끓임으로써 항체 및 고체 지지로부터 방출된다.
풀다운 분석체는 항체와 는 달리 "미끼" 단백질의 사용에서만 다른 공동 면역 침전과 유사합니다. 분자 생물학 기술을 통해 이 미끼 단백질은 일련의 히스티딘 잔류물과 같은 친화성 태그로 설계되었습니다. 이러한 친화성 태그는 "크로마토그래피 기반 생체 분자 분리"에 설명되어 있습니다. 단백질은 태그에 특정 고정 된 친화성 리간드에 캡처됩니다. 그 때 붙잡힌 단백질은 "미끼"로 복합체를 형성하는 단백질을 포함하는 견본으로 인큐베이션됩니다. 단백질 복합체는 "미끼" 단백질에 대한 태그에 특이적인 경쟁적인 별립을 포함하는 용액으로 세척함으로써 친화성 지원으로부터 방출된다. 풀다운 분석은 공동 면역 강수량에 의해 예측된 단백질 상호 작용을 확인하고, 알려지지 않은 단백질 상호 작용을 발견하는 데 유용합니다.
이제 공동 면역 강수량 및 풀다운 분석의 원리가 논의되었으므로 실험실 절차를 살펴 보겠습니다.
먼저 공동 면역 침전을 논의해 봅시다. 일련의 마이크로퍼지 튜브에, PBS 버퍼, 및 항체에 결합하는 수지 단백질 복합체인 단백질 A-sepharose의 50% 용액이 추가된다. 미세 분리 튜브는 적절한 분포를 보장하기 위해 회전한 다음 수지를 추가 PBS 버퍼로 세척합니다. 세포 용액, 원하는 단백질을 함유하고, 항체의 2 μg가 마이크로퍼지 튜브에 첨가되고, 혼합물은 4°C에서 1시간 동안 회전된다. 구슬은 원심분리에 의해 펠릿화되고, 상류체는 폐기되고, 비결합 단백질을 제거하기 위해 완충제로 세 번 재세척된다. 항체-단백질 복합체를 함유하는 구슬은 SDS-PAGE 시료 로딩 버퍼를 감소시키고, 항체로부터 복합체를 제거하고 SDS-PAGE 및 면역블로팅에 의한 분석을 위한 것이다.
이제 우리는 풀다운 에세이에 대한 절차를 논의 할 것이다 : "미끼"단백질은 적절한 친화성 태그와 플라스미드로 표현된다. 로그 상 성장에 도달 한 후, 세포는 lysed, 다음 원심 분리. 비틴 태그가 붙은 "미끼" 단백질을 포착하는 염혈막-세파로즈 구슬은 마이크로퍼지 튜브로 피펫처리됩니다. 구슬은 원심 분리되고 상부는 포부에 의해 조심스럽게 제거됩니다. 그런 다음 구슬을 버퍼, 원심 분리 및 상부제거로 세척합니다.
"미끼" 단백질에 대한 친화력을 가한 putative "prey" 단백질을 함유한 세포는 원심분리에 의해 수확됩니다. 상피체는 수지를 포함하는 마이크로퍼지 튜브에 첨가되고, 셰이커에서 3시간 동안 4°C에서 배양한다. 수지는 원심 분리되고, 상피가 제거되고, 수지는 결합되지 않은 단백질을 제거하기 위해 세척됩니다. 용출 버퍼는 수지에 첨가되고, 혼합물은 셰이커에 30 분 동안 실온에서 배양된다. 수지는 원심분리되고, 원하는 복합체를 포함하는 상피제는 면역블로팅에 의해 분석된다.
이제 절차를 검토한 결과, 공동 면역 침전 및 풀다운 분석의 유용한 응용 분야 중 일부를 살펴보겠습니다.
공동 면역 침전은 효소의 작용 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 유용할 수 있습니다. Myxovirus-또는 Mx-, 내성 단백질은 기전이 제대로 이해되지 않는 인플루엔자 A를 포함한 광범위한 바이러스를 억제합니다. 공존성전성은 마우스 Mx1 단백질과 인플루엔자 뉴클레오단백질 간의 상호작용을 연구하기 위해 사용되었다.
풀다운 분석에는 세포 환경으로부터 신호를 전달하는 단백질인 두 번째 메신저의 효과를 연구하는 데 유용하다는 것이 입증되었습니다. 그(것)들은 다중 단백질이 환경 단서에 응하여 상호 작용하는 신호 통로의 분대입니다. 칼슘 이온은 칼모둘린에 결합하여 이차 메신저 역할을 하며, 이는 다양한 단백질에 결합하여 많은 유형의 생물학적 반응을 중재합니다. 칼슘이 없으면 단백질은 칼모둘린에 결합할 수 없습니다. 탈당 분석법은 칼슘 이온의 존재 또는 부재에서 칼모둘린에 결합하는 단백질의 능력을 테스트하기 위하여 실시되었습니다.
공동 면역 침전 및 풀다운 분석은 일반적으로 안정적이거나 강한 단백질 상호 작용을 분석하는 데 사용되지만 일시적인 분석은 아닙니다. 풀다운 에세이의 최근 개발, HaloTag, 일시적인 단백질 상호 작용의 연구를 단순화했다; HaloTag는 유전적으로 인코딩된 단백질 융합 태그로, 관심 있는 단백질에 융합되어 할랄카 고체 지지체로 화학적으로 반응할 수 있습니다. 기능적 분석이 바람직한 경우, 단백질 복합체는 태그를 뺀 다음 담배 에칭 바이러스 프로테아제로 인큐베이팅하여 격리될 수 있습니다.
당신은 단지 공동 면역 침전 및 풀다운 분석에 JoVE의 비디오를 보았다. 이 비디오는 두 가지 방법의 원리, 일반 실험실 절차 및 일부 응용 분야에 대해 설명했습니다.
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이해 상충이 선언되지 않았습니다.
