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Ensaios de Co-Imunoprecipitação e Pull-Down
 
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Ensaios de Co-Imunoprecipitação e Pull-Down

Overview

Os ensaios de co-imunoprecipitação (CoIP) e pull-down são métodos intimamente relacionados para identificar interações proteína-proteína estáveis. Esses métodos estão relacionados à imunoprecipitação, um método para separar uma proteína alvo ligada a um anticorpo de proteínas não ligadas. No CoIP, uma proteína ligada a anticorpos está ligada a outra proteína que não se liga ao anticorpo, isso é seguido por um processo de separação que preserva o complexo proteína-proteína. A diferença nos ensaios puxados para baixo é que as proteínas de isca marcadas por afinidade substituem anticorpos, e a cromatografia de afinidade é usada para isolar complexos proteína-proteína.

Este vídeo explica coip, ensaios pull-down, e sua implementação em laboratório. Um protocolo passo-a-passo para cada técnica é coberto, incluindo os reagentes, aparelhos e instrumentos usados para purificar e analisar proteínas ligadas. Além disso, a seção de aplicações deste vídeo descreve um procedimento para estudar como as proteínas do micovírus inibem a nucleoproteína da gripe, uma investigação sobre o papel dos íons de cálcio na calmodulina através de um ensaio de puxar para baixo, e um ensaio de puxar para baixo modificado para caracterizar interações proteicas transitórias.

As interações proteína-proteína desempenham um papel significativo em uma grande variedade de funções biológicas. A maioria das interações proteína-proteína e seus efeitos biológicos ainda não foram identificados. A co-imunoprecipitação, ou CoIP, e ensaios puxados para baixo são dois métodos intimamente relacionados para a identificação de interações proteína-proteína estáveis. Este vídeo abordará os princípios dos dois ensaios, seus procedimentos laboratoriais gerais e aplicações dessas técnicas.

Os ensaios coIP e pull-down são variantes da imunoprecipitação, um método para isolar seletivamente uma espécie proteica de uma solução complexa. Em um experimento de imunoprecipitação, um anticorpo específico para uma proteína alvo é permitido formar um complexo imunológico com esse alvo na amostra. O complexo é então capturado em um suporte sólido, tipicamente proteína A ligada a uma conta de sepharose. Quaisquer proteínas não capturadas são removidas por etapas de centrifugação. A proteína é então liberada do anticorpo e suporte sólido, fervendo na redução do buffer de carga amostral SDS-PAGE.

A co-imunoprecipitação é conduzida da mesma forma, exceto que complexos proteicos intactos são capturados no suporte sólido. O anticorpo se liga à proteína alvo, que, por sua vez, está ligada a outra proteína que não é alvo do anticorpo. Como na imunoprecipitação, o complexo proteico é liberado do anticorpo e suporte sólido, fervendo na redução do buffer de carga de amostras SDS-PAGE.

Os ensaios de recuo são semelhantes à co-imunoprecipitação, diferindo apenas no uso de uma proteína "isca", em oposição a um anticorpo. Através de técnicas de biologia molecular, essa proteína de isca é projetada com uma etiqueta de afinidade, como uma série de resíduos de histidina. Essas etiquetas de afinidade são descritas em "Separações biomoléculas baseadas em cromatografia". A proteína é então capturada em um ligante de afinidade imobilizado específico para a tag. A proteína capturada é então incubada com uma amostra que contém proteínas que formam complexos com a "isca". O complexo proteico é liberado do suporte de afinidade por meio da lavagem com uma solução contendo um analito competitivo específico para a tag na proteína "isca". Ensaios puxados para baixo são úteis para confirmar interações proteicas previstas pela co-imunoprecipitação, e para descobrir interações proteicas desconhecidas.

Agora que os princípios da co-imunoprecipitação e dos ensaios de retirada foram discutidos, vamos olhar para seus procedimentos laboratoriais.

Primeiro vamos discutir a co-imunoprecipitação. Para uma série de tubos de microfuge, acrescenta-se: tampão PBS, e uma solução de 50% de proteína A-sepharose, um complexo de proteína de resina que se liga ao anticorpo. Os tubos de microfuge são girados para garantir a distribuição adequada e, em seguida, a resina é lavada com tampão PBS adicional. O linsato celular, contendo a proteína desejada, e 2 μg de anticorpo são adicionados aos tubos de microfuça, e a mistura é girada por 1h a 4 °C. As contas são pelotas por centrifugação, o sobrenante é descartado, e as contas relavadas três vezes com tampão para remover proteínas não ligadas. As contas que contêm o complexo anticorpo-proteína estão na redução do buffer de carga amostral SDS-PAGE, para remoção do complexo do anticorpo e para análise por SDS-PAGE e imunoblotting.

Agora discutiremos o procedimento para ensaios de retirada: A proteína "isca" é expressa em um plasmídeo com a etiqueta de afinidade apropriada. Depois de atingir o crescimento da fase de registro, as células são diluidas e, em seguida, centrifadas. As contas de streptavidin-sepharose suspensas, que capturam proteína "isca" marcada por biotina, são insustadas em um tubo de microfuge. As contas são então centrifadas e o supernatante cuidadosamente removido por aspiração. As contas são então lavadas com tampão, centrifugadas e removidas pelo supernatante.

As células que contêm a proteína putativa "presa", que tem afinidade com a proteína "isca", são colhidas por centrifugação. O supernascer é então adicionado ao tubo de microfuge contendo a resina, e incubado a 4 °C por 3 h em um shaker. A resina é então centrifugada, o supernacido removido, e a resina lavada para remover proteínas não ligadas. O tampão de elução é adicionado à resina, e a mistura é incubada à temperatura ambiente por 30 minutos em um shaker. A resina é então centrifugada, e o supernatante contendo o complexo desejado é analisado por imunoblotação.

Agora que revisamos os procedimentos, vamos ver algumas das aplicações úteis de co-imunoprecipitação e ensaios puxados para baixo.

A co-imunoprecipitação pode ser útil na melhor compreensão do mecanismo de ação das enzimas. As proteínas de resistência myxovirus- ou Mx-, inibem uma ampla gama de vírus, incluindo a influenza A, para a qual o mecanismo é mal compreendido. A co-imunoprecipitação foi utilizada para estudar a interação entre a proteína Mx1 do camundongo e a nucleoproteína da gripe.

Os ensaios puxados para baixo têm se mostrado úteis no estudo dos efeitos dos segundos mensageiros, que são proteínas que comunicam um sinal do ambiente celular. Eles são um componente de uma via de sinalização onde múltiplas proteínas interagem em resposta a pistas ambientais. Os íons de cálcio atuam como mensageiros secundários, vinculando-se à calmodulina, que, por sua vez, se liga a uma grande variedade de proteínas, mediando muitos tipos de respostas biológicas. Sem o cálcio, a proteína não pode se ligar à calmodulina. Um ensaio puxado para baixo foi realizado para testar a capacidade das proteínas de se ligarem à calmodulina na presença ou ausência de íons de cálcio.

Ensaios de co-imunoprecipitação e pull-down são geralmente usados para analisar interações proteicas estáveis ou fortes, mas não transitórias. Um desenvolvimento recente em ensaios puxados para baixo, o HaloTag, simplificou o estudo de interações proteicas transitórias; HaloTag é uma etiqueta de fusão de proteínas geneticamente codificada, fundida à proteína de interesse, capaz de reagir quimicamente com um suporte sólido haloalkane. Se a análise funcional for desejada, o complexo proteico, menos a tag, em sua totalidade poderia então ser isolado incubando com protease do vírus da etch do tabaco.

Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre co-imunoprecipitação e ensaios puxados para baixo. Este vídeo descreveu os princípios dos dois métodos, os procedimentos laboratoriais gerais e algumas de suas aplicações.

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Procedure

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Os ensaios de co-imunoprecipitação (CoIP) e pull-down são métodos intimamente relacionados para identificar interações proteína-proteína estáveis. Esses métodos estão relacionados à imunoprecipitação, um método para separar uma proteína alvo ligada a um anticorpo de proteínas não ligadas. No CoIP, uma proteína ligada a anticorpos está ligada a outra proteína que não se liga ao anticorpo, isso é seguido por um processo de separação que preserva o complexo proteína-proteína. A diferença nos ensaios puxados para baixo é que as proteínas de isca marcadas por afinidade substituem anticorpos, e a cromatografia de afinidade é usada para isolar complexos proteína-proteína.

Este vídeo explica coip, ensaios pull-down, e sua implementação em laboratório. Um protocolo passo-a-passo para cada técnica é coberto, incluindo os reagentes, aparelhos e instrumentos usados para purificar e analisar proteínas ligadas. Além disso, a seção de aplicações deste vídeo descreve um procedimento para estudar como as proteínas do micovírus inibem a nucleoproteína da gripe, uma investigação sobre o papel dos íons de cálcio na calmodulina através de um ensaio de puxar para baixo, e um ensaio de puxar para baixo modificado para caracterizar interações proteicas transitórias.

As interações proteína-proteína desempenham um papel significativo em uma grande variedade de funções biológicas. A maioria das interações proteína-proteína e seus efeitos biológicos ainda não foram identificados. A co-imunoprecipitação, ou CoIP, e ensaios puxados para baixo são dois métodos intimamente relacionados para a identificação de interações proteína-proteína estáveis. Este vídeo abordará os princípios dos dois ensaios, seus procedimentos laboratoriais gerais e aplicações dessas técnicas.

Os ensaios coIP e pull-down são variantes da imunoprecipitação, um método para isolar seletivamente uma espécie proteica de uma solução complexa. Em um experimento de imunoprecipitação, um anticorpo específico para uma proteína alvo é permitido formar um complexo imunológico com esse alvo na amostra. O complexo é então capturado em um suporte sólido, tipicamente proteína A ligada a uma conta de sepharose. Quaisquer proteínas não capturadas são removidas por etapas de centrifugação. A proteína é então liberada do anticorpo e suporte sólido, fervendo na redução do buffer de carga amostral SDS-PAGE.

A co-imunoprecipitação é conduzida da mesma forma, exceto que complexos proteicos intactos são capturados no suporte sólido. O anticorpo se liga à proteína alvo, que, por sua vez, está ligada a outra proteína que não é alvo do anticorpo. Como na imunoprecipitação, o complexo proteico é liberado do anticorpo e suporte sólido, fervendo na redução do buffer de carga de amostras SDS-PAGE.

Os ensaios de recuo são semelhantes à co-imunoprecipitação, diferindo apenas no uso de uma proteína "isca", em oposição a um anticorpo. Através de técnicas de biologia molecular, essa proteína de isca é projetada com uma etiqueta de afinidade, como uma série de resíduos de histidina. Essas etiquetas de afinidade são descritas em "Separações biomoléculas baseadas em cromatografia". A proteína é então capturada em um ligante de afinidade imobilizado específico para a tag. A proteína capturada é então incubada com uma amostra que contém proteínas que formam complexos com a "isca". O complexo proteico é liberado do suporte de afinidade por meio da lavagem com uma solução contendo um analito competitivo específico para a tag na proteína "isca". Ensaios puxados para baixo são úteis para confirmar interações proteicas previstas pela co-imunoprecipitação, e para descobrir interações proteicas desconhecidas.

Agora que os princípios da co-imunoprecipitação e dos ensaios de retirada foram discutidos, vamos olhar para seus procedimentos laboratoriais.

Primeiro vamos discutir a co-imunoprecipitação. Para uma série de tubos de microfuge, acrescenta-se: tampão PBS, e uma solução de 50% de proteína A-sepharose, um complexo de proteína de resina que se liga ao anticorpo. Os tubos de microfuge são girados para garantir a distribuição adequada e, em seguida, a resina é lavada com tampão PBS adicional. O linsato celular, contendo a proteína desejada, e 2 μg de anticorpo são adicionados aos tubos de microfuça, e a mistura é girada por 1h a 4 °C. As contas são pelotas por centrifugação, o sobrenante é descartado, e as contas relavadas três vezes com tampão para remover proteínas não ligadas. As contas que contêm o complexo anticorpo-proteína estão na redução do buffer de carga amostral SDS-PAGE, para remoção do complexo do anticorpo e para análise por SDS-PAGE e imunoblotting.

Agora discutiremos o procedimento para ensaios de retirada: A proteína "isca" é expressa em um plasmídeo com a etiqueta de afinidade apropriada. Depois de atingir o crescimento da fase de registro, as células são diluidas e, em seguida, centrifadas. As contas de streptavidin-sepharose suspensas, que capturam proteína "isca" marcada por biotina, são insustadas em um tubo de microfuge. As contas são então centrifadas e o supernatante cuidadosamente removido por aspiração. As contas são então lavadas com tampão, centrifugadas e removidas pelo supernatante.

As células que contêm a proteína putativa "presa", que tem afinidade com a proteína "isca", são colhidas por centrifugação. O supernascer é então adicionado ao tubo de microfuge contendo a resina, e incubado a 4 °C por 3 h em um shaker. A resina é então centrifugada, o supernacido removido, e a resina lavada para remover proteínas não ligadas. O tampão de elução é adicionado à resina, e a mistura é incubada à temperatura ambiente por 30 minutos em um shaker. A resina é então centrifugada, e o supernatante contendo o complexo desejado é analisado por imunoblotação.

Agora que revisamos os procedimentos, vamos ver algumas das aplicações úteis de co-imunoprecipitação e ensaios puxados para baixo.

A co-imunoprecipitação pode ser útil na melhor compreensão do mecanismo de ação das enzimas. As proteínas de resistência myxovirus- ou Mx-, inibem uma ampla gama de vírus, incluindo a influenza A, para a qual o mecanismo é mal compreendido. A co-imunoprecipitação foi utilizada para estudar a interação entre a proteína Mx1 do camundongo e a nucleoproteína da gripe.

Os ensaios puxados para baixo têm se mostrado úteis no estudo dos efeitos dos segundos mensageiros, que são proteínas que comunicam um sinal do ambiente celular. Eles são um componente de uma via de sinalização onde múltiplas proteínas interagem em resposta a pistas ambientais. Os íons de cálcio atuam como mensageiros secundários, vinculando-se à calmodulina, que, por sua vez, se liga a uma grande variedade de proteínas, mediando muitos tipos de respostas biológicas. Sem o cálcio, a proteína não pode se ligar à calmodulina. Um ensaio puxado para baixo foi realizado para testar a capacidade das proteínas de se ligarem à calmodulina na presença ou ausência de íons de cálcio.

Ensaios de co-imunoprecipitação e pull-down são geralmente usados para analisar interações proteicas estáveis ou fortes, mas não transitórias. Um desenvolvimento recente em ensaios puxados para baixo, o HaloTag, simplificou o estudo de interações proteicas transitórias; HaloTag é uma etiqueta de fusão de proteínas geneticamente codificada, fundida à proteína de interesse, capaz de reagir quimicamente com um suporte sólido haloalkane. Se a análise funcional for desejada, o complexo proteico, menos a tag, em sua totalidade poderia então ser isolado incubando com protease do vírus da etch do tabaco.

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