真核生物之间分子机制的保守性奠定了利用模式生物进行研究的强大基础。许多此类模式系统便于采用反向遗传学方法，例如靶向基因敲除，以鉴定某个基因产物在特定生物学过程或疾病过程中的作用。历史上，斑马鱼等生物体的基因破坏技术主要依赖于靶向引入移码突变，这些突变源于双链断裂（DSB）的不精确修复1,2。当基因组中引入DSB时，DNA损伤可通过两种普遍存在于几乎所有细胞类型和生物体中的修复途径之一进行修复：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）3,4。NHEJ机制的不精确性常常导致产生不同长度的插入或缺失（indels）5,6,7,8,9。在基因编码序列中引入移码突变可导致提前出现终止密码子，通常使该基因丧失功能。
早期在斑马鱼中用于诱导插入缺失（indels）的基因组编辑策略包括巨核酸酶、锌指核酸酶以及转录激活样效应子核酸酶，这些技术均利用DNA-蛋白质相互作用将核酸酶靶向特定基因组位点，从而引入双链断裂（DSB）10,11,12,13,14,15。然而，由于需要繁琐且复杂的工程化过程来构建靶向特定DNA序列的核酸酶，这些技术通常难以应用。与先前的策略不同，基于CRISPR的基因编辑不依赖于蛋白质-DNA相互作用进行靶向。相反，CRISPR相关（Cas）内切酶通过一条RNA引导链进行导向，该引导RNA利用核苷酸碱基配对作用靶向特定的基因组位点16,17,18,19,20,21。由于设计具有理想碱基配对特性的RNA引导链非常简便，因此可相对容易地将Cas内切酶靶向至目标基因座。其中，II型CRISPR系统因其多项优势特征而在基因组编辑应用中得到了广泛开发，包括使用单一的多结构域Cas核酸酶（Cas9），该酶需与DNA结合以激活其内切酶活性，以及使用单一引导RNA（sgRNA）将其靶向至对应的DNA序列18。目前对sgRNA靶向所需的序列条件已有充分了解19，且目标sgRNA可通过体外转录（in vitro transcription）轻松制备。CRISPR/Cas9方法的简便性与高效性极大地促进了斑马鱼及多种其他生物中的靶向遗传修饰。
由于开发了基于CRISPR的试剂，斑马鱼靶向基因组编辑能力显著增强，这大大增加了研究脊椎动物典型生物学过程（如中枢神经系统发育）的机会。斑马鱼基因组包含人类基因组中70%的蛋白编码基因的同源基因，以及84%与人类疾病相关的基因22。斑马鱼的发育具有多个关键特性，使其在反向遗传学研究中更具优势：其胚胎以大量产卵方式产出，体外发育，便于通过显微注射进行遗传操作；且斑马鱼在3个月龄时即可达到性成熟，有利于快速扩增目标品系23。
已有多种实验方案描述了在斑马鱼中生成和鉴定CRISPR来源的插入缺失（indel）的不同方法24,25,26,27,28,29,30,31。然而，其中许多方法耗时较长，需要使用昂贵的设备，对于经验有限的实验室而言操作难度较大。本文所述步骤提供了一种简单、可靠且经济的CRISPR/Cas9策略，用于构建斑马鱼基因敲除品系。本方案描述了利用高效试剂盒通过DNA寡核苷酸（oligos）合成单导向RNA（sgRNA）的方法，类似于此前已报道的其他方法32。该方案特别包含两个显著简化CRISPR突变品系分析的步骤：基于PCR的杂合双链分析法（HMA）33的逐步操作，以简便地检测基因组修饰的存在；以及对杂合子斑马鱼进行测序分析，从而以经济、快速且简便的方式确定多种indel的具体性质。此外，本方案还提供了关于向导RNA的可靠筛选、稳定制备和显微注射的详细分步说明。本文所提供的操作流程展示了一种稳健且相对低成本的实验方案，使具备不同技术水平的实验室人员均能有效参与斑马鱼基因敲除的鉴定工作。
本实验的总体目标是利用 CRISPR/Cas9 技术在斑马鱼中进行靶向基因组编辑，以稳定且经济的方式构建基因敲除模型。该方法有助于回答关于基因在脊椎动物模型系统中生物学功能的关键问题，例如基因如何参与高等真核生物的发育过程。通过这些简单而可靠的实验流程，各级经验水平的实验室人员（包括本科生）均可在斑马鱼中实现靶向基因组修饰。
初次接触该方法的研究人员应能够根据逐步说明，确定CRISPR诱变的最佳基因组靶点，完成斑马鱼胚胎的显微注射，并鉴定出修饰后的等位基因。本方法的可视化演示至关重要，因为该方法主要面向可能对其中一项或多项必要技术不熟悉的本科生。文本方案中提供了用于指导RNA合成的模板特异性寡核苷酸设计指南。
首先，将Cas9蛋白悬浮于缓冲液中，配制浓度为1毫克/毫升的溶液。将该溶液分装成适合注射的 aliquot，于-80摄氏度保存，以备后续使用。随后，按照本文章材料部分推荐的体外转录试剂盒（如文中所述）的制造商说明书合成sgRNA。
使用无RNA酶的乙酸铵沉淀法纯化合成的sgRNA。向合成的RNA中加入25微升5摩尔的乙酸铵，通过涡旋混合溶液。接着，向样品中加入150微升200度无核酸酶乙醇。
将反应物置于–80摄氏度的冰箱中至少20分钟。随后，以最大速度离心样品。使用移液器小心移除上清液，注意不要扰动RNA沉淀。
然后加入1毫升70%乙醇，反复倒置离心管数次，以洗涤管壁上残留的盐分。在4°C下以最大速度离心7分钟。使用P1000移液器吸除大部分溶液。
接下来使用P200移液器小心吸除残留溶液，注意不要扰动沉淀。为避免RNase污染，在洁净环境中将沉淀干燥，直至离心管内无可见液滴。将沉淀重悬于30 µL无RNase的水中，并使用分光光度计对产物进行定量。
将溶液分装后于-80摄氏度长期保存。接下来，取300至500纳克的sgRNA与等体积的2X RNA上样缓冲液混合。然后，使用P1000移液器，用电泳缓冲液反复冲洗琼脂糖凝胶的每个加样孔，以清除其中的杂质。
将溶液加入琼脂糖凝胶孔中，并以每厘米10伏的电压电泳足够时间，使RNA条带在凝胶中充分分离。电泳时间可能因电泳装置不同而有所差异。一般情况下，应使染料前沿迁移至凝胶长度的2/3处。
然后使用核酸染料对条带进行可视化。完整的 RNA 呈现为单一的条带，如本图中第 1 泳道和第 2 泳道所示。降解的 RNA 则呈现为弥散条带，如第 3 泳道所示。
首先，按照文本方案中的描述，在进行注射前一晚准备好用于繁殖的斑马鱼实验对象。然后将 Cas9 蛋白与 sgRNA 按 2:1 的比例混合。在室温下孵育该溶液 5 分钟，使 Cas9 与 sgRNA 形成核糖核蛋白复合物。
然后加入0.5 µL的2.5%酚红溶液，并用足量的无RNA酶水稀释，使终体积达到5 µL。为制备注射针，使用微量移液器拉制仪将一根直径1毫米的玻璃毛细管拉制成针。随后用剃刀片切割所得玻璃针的尖端，以获得一个倾斜的开口。
将针头安装到连接显微注射仪的显微操作器上。在光学显微镜下调节注射压力，直至针头能在培养皿中稳定地注入一纳升溶液。在进行胚胎显微注射前，应练习制备针头，并使用仅含染料的溶液对对照胚胎进行注射操作，记录发育24小时后的存活率。
与未注射的对照组相比，存活率应能达到90%以上。接下来，选取10至15枚胚胎作为对照群体，置于另一个标记好的培养皿中。使用移液器，将剩余的胚胎小心地排列在室温下的注射板上。
在解剖显微镜下，将一纳升溶液注射到每个胚胎的卵黄囊中。然后将注射后的胚胎放回已标记的培养皿中，并用含亚甲蓝的1× E3培养基覆盖。将注射后的胚胎置于28摄氏度的培养箱中孵育24小时。
随后检查已注射的胚胎，剔除死亡或发育异常的个体。首先，从含有已注射胚胎的培养皿中收集两组各五个72小时龄的胚胎，并从未注射的对照组中收集一组五个72小时龄的胚胎，分别放入微量离心管中。轻轻吸去每组胚胎的培养液，并将胚胎麻醉。
两分钟后移除麻醉剂，加入45微升50毫摩尔的氢氧化钠。然后在95摄氏度下孵育样品10分钟。接着将样品从孵育器中取出，使其冷却至室温。
加入5 µL 1 M pH值为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液，充分涡旋混匀样品。然后在室温下以最高速度离心3分钟。将含有基因组DNA的上清液转移至一个新的已标记试管中，并将gDNA于-20 °C保存。
使用文中所述设计的引物扩增sgRNA靶向区域附近的片段，以进行异源双链分析。采用PCR纯化试剂盒对PCR反应产物进行纯化。将样品溶于30微升水中，并使用分光光度计对DNA进行定量。
将含有PCR扩增产物的试管放入沸水浴中的浮置试管架中。随后使用30%丙烯酰胺配制15%聚丙烯酰胺TBE凝胶。待凝胶凝固后，将其放入含有TBE电泳缓冲液的电泳装置中。
然后将500纳克复性后的PCR产物上样，并在每组sgRNA样本旁边上样一个对照。以150伏电压电泳两个半小时，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。将HMA中显示杂合双链条带的显微注射斑马鱼胚胎培育至成年。
为解读高分辨率熔解曲线分析（HMA）结果，需比较野生型未注射对照样本与相应注射样本在PCR后产生的同源双链条带的强度。若切割效率足够高，注射鱼样本的条带强度应比野生型对照低约50%。为确认潜在创始人亲本鱼中存在插入/缺失突变（indels），使用0.004%三卡因麻醉鱼类，并用洁净的剃须刀片切除尾鳍的1/2至3/4部分。
然后，将尾鳍组织放入 45 µL 的 50 mmol/L 氢氧化钠溶液中。将鱼放回恢复用鱼缸，并按照之前所述方法进行基因组 DNA 提取。接着，对尾鳍组织提取的基因组 DNA 进行 HMA 分析，以确定该个体是否通过 CRISPR 注射成功实现基因修饰。
然后将尾部DNA中显示异源双链带型的成年鱼与野生型鱼杂交。根据HMA对混合样本的分析结果，筛选 founder 鱼以产生F1代鱼。最后，对目标鱼的基因组DNA进行测序，以鉴定插入缺失（indel）的性质。
在成功制备并显微注射CRISPR试剂后，利用HMA分析斑马鱼胚胎的明显表型及插入缺失（indel）的形成情况。Cas9在酪氨酸酶（tyrosinase）基因位点诱导产生的插入缺失会导致色素缺失，该表型在受精后48小时即可通过肉眼轻松判别。对于未引起明显发育表型的CRISPR修饰等位基因，则通过HMA进行鉴定。
成功靶向目标基因将导致异源双链带的形成，并使同源双链带的强度降低，如第3和第4泳道所示。请勿忘记，使用脊椎动物进行实验负有伦理责任。本方案描述了减少获得基因敲除所需斑马鱼数量的策略，这一目标在执行该操作时应予以充分考虑。
一旦掌握，该技术可用于快速生成并鉴定携带 CRISPR 修饰等位基因的斑马鱼，这些等位基因能够以高效率通过生殖系遗传。重要的是，该技术已优化为低成本方法，适合本科生及缺乏经验的研究人员操作。观看本视频后，您应能充分理解如何简便地设计并实施基于 CRISPR 的斑马鱼基因敲除方法。