Die Erhaltung der molekularen Maschinerie in Eukaryoten zugrunde liegt die Macht der Verwendung Modellorganismen für die Forschung. Viele dieser Modellsysteme erleichtern die Verwendung von Reverse-gentechnische Ansätze wie gezielte gen Knockouts, den Beitrag eines gen-Produktes um einen biologischen oder Krankheit Prozess zu charakterisieren. Gen Störung Techniken in Organismen wie dem Zebrafisch haben sich historisch auf gezieltes einbringen von Frameshift-Mutationen verlassen, die durch ungenaue Reparatur von DSB¹^,²entstehen. Wenn ein DSB in das Genom eingebracht wird, ist die DNA-Läsion durch einen der beiden Wege, die universell in fast allen Arten von Zellen und Organismen vorhanden sind repariert: nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ) und unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR)³^,⁴. Die Ungenauigkeit der NHEJ Maschinen produziert häufig Indels von verschiedenen Längen⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹. Einführung von Frameshift-Mutationen in der kodierenden Sequenz eines Gens kann ein vorzeitiges Stopcodon produzieren, die oft das Gen nicht funktionsfähig macht.

Frühen Genom engineering Strategien im Zebrafisch Förderung Indels enthalten Meganucleases, Zinkfinger-Nukleasen und Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nukleasen, die DNA-Protein Interaktionen um eine Nuclease auf einen bestimmten genomische gezielt genutzt Ziel, wo es ein DSB¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵eingeführt. Diese Technologien sind jedoch oft schwierig, gelten aufgrund der aufwändige und komplexe Technik musste eine Nuklease zu generieren, die die DNA Reihenfolge des Interesses richtet sich an. Im Gegensatz zu bisherigen Strategien verlassen CRISPR-basierte gen bearbeiten nicht auf Protein-DNA-Wechselwirkungen für die Zielgruppenadressierung. Stattdessen CRISPR-assoziierten (Cas)-Endonuklease über eine RNA-Leitfaden richtet sich das Nukleotid base pairing Interaktionen verwendet, um gezielt eine genomische Website Interesse¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹ ^,²⁰^,²¹. Aufgrund der Einfachheit der Gestaltung einer RNS ist Guide mit der gewünschten Basis Paarung Interaktionen für die Zielgruppenadressierung es relativ einfach, die Cas-Endonuklease an den gewünschten Ort zu richten. Typ II CRISPR-System wurde vor allem weit entwickelt für Genom-editing-Anwendungen durch mehrere vorteilhafte Eigenschaften, einschließlich der Verwendung von einem einzigen multidomain Cas-Nuklease (Cas9), die Interaktion mit DNA Endonuklease Aktivität stimulieren erfordert und von einer einzigen Führer RNS (SgRNA) nutzen, um es auf den cognate DNA-Sequenz¹⁸Ziel. Voraussetzungen die Sequenz für das targeting von verwandten SgRNA sind gut verstanden¹⁹, und die gewünschte SgRNA wird leicht durch in Vitro Transkription generiert. Die Einfachheit und Robustheit der CRISPR/Cas9 Ansatz erleichtert die gezielte gentechnische Veränderung im Zebrafisch und eine Vielzahl von anderen Organismen.

Die verbesserte Fähigkeit zu übernehmen hat gezielte Genom-Bearbeitung im Zebrafisch als Folge entwickeln CRISPR-basierte Reagenzien erheblich erhöht die Möglichkeit, Prozesse Sinnbild für Wirbeltiere Organismen wie Entwicklung der das zentrale Nervensystem zu studieren System. Das Zebrafish Genom enthält Orthologe von 70 % der Protein-kodierenden Gene im menschlichen Genom sowie 84 % der Gene im Zusammenhang mit Krankheiten im Menschen²²gefunden. Zebrafisch Entwicklung weist mehrere wichtige Eigenschaften, die seine Verwendung in umgekehrter genetische Studien zu verbessern: die Embryonen sind in große Gelege gelegt, nach außen zu entwickeln, von der Mutter, so dass sie offen für genetische Manipulation durch Mikroinjektion und Erwachsenen Zebrafisch geschlechtsreif mit 3 Monaten, so dass für die rasche Ausbreitung der gewünschten Linien²³.

Zahlreiche Protokolle stehen zur Verfügung, die beschreiben eine Vielzahl von Ansätzen zu generieren und zu identifizieren CRISPR-abgeleitete Indels im Zebrafisch²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹ ^,³⁰^,³¹. Aber viele dieser Verfahren sind zeitintensiv, benötigen Zugriff auf teure Ausrüstung und können schwierig sein, für Labors mit begrenzten Kompetenzen. Die hier beschriebenen Schritte bieten eine einfache, robuste und wirtschaftliche CRISPR/Cas9-Strategie zu Ingenieur Zebrafisch ko-Linien. Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines hocheffizienten Kit SgRNAs mit DNA-Oligonukleotide (Oligos) zu synthetisieren, ähnlich wie andere Ansätze, die zuvor beschriebenen³². Das beschriebene Protokoll umfasst zwei Schritte insbesondere, die Analyse der CRISPR mutiert erheblich vereinfachen: Schritt für Schritt Verwendung der PCR-basierter HMA³³ , leicht feststellen, das Vorhandensein von Genom-Modifikationen und Sequenzierung Analyse der heterozygot Zebrafisch, schnell und einfach die Natur mehrere Indels auf wirtschaftliche Weise zu bestimmen. Darüber hinaus sind schrittweise Anleitungen für robuste Auswahl, zuverlässige Produktion und Injektion des Guide RNAs enthalten. Die hier angegebenen Schritte veranschaulichen eine robustere, relativ kostengünstige Protokoll, die Laborpersonal mit ein Spektrum an Fachwissen zur Identifizierung des Gens Knockouts im Zebrafisch beitragen kann.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine gezielte Genom-Editierung mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Technologie im Zebrafisch durchzuführen, um Gen-Knockouts auf robuste und kostengünstige Weise zu erzeugen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zur biologischen Rolle eines Gens im Kontext eines Wirbeltiermodellsystems zu beantworten, z. B. wie ein Gen zu Entwicklungsprozessen in Eukaryoten höherer Ordnung beiträgt. Mit diesen einfachen, robusten Verfahren kann Laborpersonal aller Erfahrungsstufen, einschließlich Studenten, gezielte genomische Modifikationen im Zebrafisch durchführen.

Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, sollten in der Lage sein, die Schritt-für-Schritt-Anleitung zu befolgen, um optimale genomische Ziele für die CRISPR-Mutagenese zu identifizieren, eine Mikroinjektion von Zebrafischembryonen durchzuführen und modifizierte Allele zu identifizieren. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da diese Methode für Studenten gedacht ist, die mit einer oder mehreren der erforderlichen Techniken nicht vertraut sind. Richtlinien für das Design von Template-spezifischen Oligos für die Produktion von Guide-RNA sind im Textprotokoll enthalten.

Zu Beginn suspendieren Sie das Cas9-Protein in Puffer, um eine Lösung von einem Milligramm pro Milliliter zu erzeugen. Lagern Sie diese Lösung in injektionsfertigen Aliquoten bei minus 80 Grad Celsius für die spätere Verwendung. Synthetisieren Sie dann die sgRNA mit einem In-vitro-Transkriptionskit, wie es in den Materialien dieses Artikels gemäß den Anweisungen des Herstellers vorgeschlagen wird.

Aufreinigung der synthetisierten sgRNA mit einer RNAse-freien Ammoniumacetat-Fällung. Geben Sie 25 Mikroliter fünfmolares Ammoniumacetat zur synthetisierten RNA und mischen Sie die Lösung durch Vortexen. Geben Sie anschließend 150 Mikroliter 200 Proof nukleasefreies Ethanol in die Probe.

Und lege die Reaktion für mindestens 20 Minuten in einen Gefrierschrank bei minus 80 Grad Celsius. Anschließend zentrifugieren Sie die Proben bei maximaler Geschwindigkeit. Verwenden Sie eine Pipette, um den Überstand zu entfernen, und achten Sie darauf, das RNA-Pellet nicht zu stören.

Fügen Sie dann einen Milliliter 70%Ethanol hinzu und drehen Sie das Rohr mehrmals um, um das restliche Salz aus dem Rohr zu waschen. Zentrifugieren Sie erneut bei maximaler Geschwindigkeit bei vier Grad Celsius für sieben Minuten. Verwenden Sie eine P1000-Pipette, um den größten Teil der Lösung zu entfernen.

Verwenden Sie anschließend eine P200-Pipette, um so viel wie möglich von der restlichen Lösung zu entfernen, ohne das Pellet zu stören. Achten Sie darauf, eine RNA-Kontamination zu vermeiden, und trocknen Sie das Pellet an einem sauberen Ort, bis keine Flüssigkeitstropfen mehr im Röhrchen sichtbar sind. Resuspendieren Sie das Pellet in 30 Mikrolitern RNAse-freiem Wasser und verwenden Sie ein Spektralphotometer, um das Produkt zu quantifizieren.

Aliquotieren Sie die Lösung für die Langzeitlagerung bei minus 80 Grad Celsius. Mischen Sie als Nächstes 300 bis 500 Nanogramm sgRNA mit einem gleichen Volumen an 2X RNA-Gelladefarbstoff. Befreien Sie dann mit einer P1000-Pipette jede der Agarosegel-Vertiefungen mehrmals mit laufendem Puffer von Ablagerungen.

Laden Sie die Lösungen in die Vertiefungen des Agarosegels und lassen Sie das Gel mit 10 Volt pro Zentimeter ausreichend lange laufen, um die RNA-Banden auf dem Gel zu trennen. Die Zeit kann je nach Elektrophoresegerät variieren. Im Allgemeinen sollte die Färbefront auf 2/3s Länge des Gels verlaufen.

Verwenden Sie dann eine Nukleinsäurefärbung, um die Banden sichtbar zu machen. Intakte RNA erscheint als einzelne Bande, wie hier auf Spur eins und zwei. Degradierte RNA verläuft als Abstrich, wie z. B. auf Bahn drei.

Bereiten Sie zunächst die Zebrafisch-Probanden in der Nacht vor der Durchführung der Injektionen auf die Zucht vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Kombinieren Sie dann Cas9-Protein und sgRNA in einem Verhältnis von zwei zu eins. Inkubieren Sie die Lösung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur, während Cas9 und sgRNA einen Ribonukleoproteinkomplex bilden.

Fügen Sie dann 0,5 Mikroliter 2,5%ige Phenolrotlösungen in ausreichend RNAse-freiem Wasser hinzu, um ein Endvolumen von fünf Mikrolitern zu erreichen. Um die Injektionsnadel vorzubereiten, verwenden Sie einen Mikropipettenabzieher, um eine ein Millimeter große Glaskapillare zu ziehen. Schneide dann die Spitze der entstandenen Glasnadel mit einer Rasierklinge ab, um eine abgewinkelte Öffnung zu erhalten.

Legen Sie die Nadel in einen Mikromanipulator, der an einem Mikroinjektor befestigt ist. Stellen Sie mit einem Lichtmikroskop den Injektionsdruck so lange ein, bis die Nadel gleichmäßig einen Nanometer Lösung in die Petrischale injiziert. Üben Sie vor der Mikroinjektion von Embryonen die Vorbereitung von Nadeln und die Injektion von Kontrollembryonen mit einer reinen Farbstofflösung und notieren Sie das Überleben nach 24 Stunden Entwicklung.

Sie sollten in der Lage sein, eine Überlebensrate von mehr als 90% im Vergleich zu einer nicht injizierten Kontrolle zu erreichen. Wählen Sie als Nächstes 10 bis 15 Embryonen als Kontrollpopulation aus und legen Sie sie in eine separate, beschriftete Petrischale. Richten Sie die verbleibenden Embryonen mit einer Transferpipette vorsichtig auf einer Injektionsplatte bei Raumtemperatur aus.

Injizieren Sie unter einem Präpariermikroskop einen Nanoliter der Lösung in den Dottersack jedes Embryos. Geben Sie dann die injizierten Embryonen in eine beschriftete Petrischale zurück und bedecken Sie sie mit 1X E3-Medium mit Methylenblau. Legen Sie die injizierten Embryonen für 24 Stunden in einen Inkubator bei 28 Grad Celsius.

Untersuchen Sie dann die injizierten Embryonen, um tote oder sich abnormal entwickelnde Individuen zu entfernen. Zuerst werden zwei Sätze von fünf 72 Stunden alten Embryonen von den Platten mit den injizierten Embryonen und ein Satz von fünf 72 Stunden alten Embryonen aus der nicht injizierten Kontrollgruppe in die Mikrozentrifugenröhrchen entnommen. Pipettieren Sie das Medium vorsichtig von jedem Embryosatz und betäuben Sie sie.

Entfernen Sie das Anästhetikum nach zwei Minuten und fügen Sie 45 Mikroliter 50 millimolare Natriumhydroxid hinzu. Dann inkubieren Sie die Proben 10 Minuten lang bei 95 Grad. Nehmen Sie anschließend die Proben aus dem Inkubator und lassen Sie sie auf Raumtemperatur abkühlen.

Fügen Sie fünf Mikroliter eines molaren pH-Tris-Hydrochlorids hinzu und wirbeln Sie die Proben kräftig ein. Dann zentrifugieren Sie die Lösung drei Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit bei Raumtemperatur. Übertragen Sie den Überstand, der die genomische DNA enthält, in ein neues markiertes Röhrchen und lagern Sie die gDNA bei minus 20 Grad Celsius.

Verwenden Sie die Primer, die für die Amplifikation um die sgRNA-Zielregion herum entwickelt wurden, wie im Text beschrieben, um ein PCR-Fragment für die Heteroduplex-Analyse zu amplifizieren. Verwenden Sie ein PCR-Aufreinigungskit, um die Produkte der PCR-Reaktion zu reinigen. Verdünnen Sie die Proben in 30 Mikrolitern Wasser und verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die DNA zu quantifizieren.

Legen Sie die Röhrchen mit den PCR-Amplikons in ein schwimmendes Gestell in ein kochendes Wasserbad. Bereiten Sie anschließend ein 15%iges Polyacrylamid-FSME-Gel mit 30%igem Polyacrylamid vor. Nachdem das Gel ausgehärtet ist, geben Sie es in ein Elektrophoresegerät mit FSME-Laufpuffer.

Laden Sie dann 500 Nanogramm der neu getemperten PCR-Produkte und laden Sie eine Kontrolle neben jeden Satz von sgRNA-Proben. Lassen Sie das Gel zweieinhalb Stunden lang bei 150 Volt laufen oder bis sich die Farbstofffront am unteren Rand des Gels befindet. Wachsen Sie mit injizierten Zebrafischembryonen bis zum Erwachsenenalter auf, die Heteroduplex-Banden im HMA aufweisen.

Um die HMA zu interpretieren, vergleichen Sie die Intensität der Homoduplex-Bande aus der PCR der Wildtyp-Kontrolle ohne Injektion mit den entsprechenden injizierten Proben. Wenn ausreichend beschnitten wurde, sollte die Intensität der Bande des injizierten Fisches etwa 50 % niedriger sein als bei der Wildtyp-Kontrolle. Um das Vorhandensein von Indels bei potentiellen Gründerelternfischen zu bestätigen, betäuben Sie den Fisch mit 0,004% Tricain und entfernen Sie mit einer sauberen Rasierklinge 1/2 bis 3/4 der Schwanzflosse.

Legen Sie dann den Schwanz in 45 Mikroliter 50 Millimolar Natriumhydroxid. Setzen Sie den Fisch in ein Auffangbecken zurück und führen Sie die gDNA-Extraktion wie zuvor beschrieben durch. Führen Sie als Nächstes eine HMA an der gDNA des Schwanzclips durch, um festzustellen, ob die Person erfolgreich durch CRISPR-Injektion verändert wurde.

Dann züchten Sie die erwachsenen Tiere, die Heteroduplex-Banden in der Schwanz-DNA aufweisen, mit Wildtyp-Fischen. Wählen Sie Gründerfische aus, um F1-Fische basierend auf der HMA-Analyse von Pools zu generieren. Sequenzieren Sie schließlich die gDNA des interessierenden Fisches, um die Art des Indels zu charakterisieren.

Nach erfolgreicher Herstellung und Mikroinjektion von CRISPR-Reagenzien wurden Zebrafischembryonen mittels HMA auf offensichtliche Phänotypen und Indelbildung analysiert. Die Cas9-induzierte Indelbildung an der Tyrosinase führt zu einem Verlust der Pigmentierung und ist 48 Stunden nach der Befruchtung leicht zu erkennen. Die Identifizierung von CRISPR-modifizierten Allelen, die nicht zu offensichtlichen Entwicklungsphänotypen führen, erfolgt mit Hilfe von HMA.

Ein erfolgreiches Targeting des interessierenden Gens führt zur Bildung von Heteroduplex-Banden und zur Verringerung der Intensität der Homoduplex-Bande, wie z. B. in den Spuren drei und vier. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem Wirbeltierorganismus eine ethische Verantwortung mit sich bringt. Dieses Protokoll beschreibt Strategien, die die Anzahl der Zebrafische minimieren, die benötigt werden, um einen Knockout zu erzielen, ein Ziel, das bei der Durchführung dieses Verfahrens berücksichtigt werden sollte.

Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie verwendet werden, um schnell Zebrafische zu generieren und zu identifizieren, die CRISPR-modifizierte Allele tragen, die mit hoher Effizienz in der Keimbahn übertragen werden. Wichtig ist, dass diese Technik so optimiert wurde, dass sie ein kostengünstiger Ansatz ist, der für Studenten und andere mit wenig Vorerfahrung zugänglich ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen CRISPR-basierten Gen-Knockout-Ansatz mit Zebrafischen einfach entwerfen und implementieren können.

Effiziente Produktion und Kennzeichnung der CRISPR/Cas9 generiert gen Knockouts im Modellsystem <em>Danio rerio</em>