La conservación de la maquinaria molecular en eucariontes es la base de la potencia del uso de organismos modelo para la investigación. Muchos de estos sistemas modelo facilitan el uso de enfoques genética reversa como knockouts de genes específicos para caracterizar la contribución de un producto del gene a un proceso biológico o enfermedad de interés. Técnicas de interrupción de genes en organismos como el pez cebra han dependido históricamente de introducción dirigida de mutaciones del mutágeno ' frameshift ' que resultan de reparación imprecisa de distritales1,2. Cuando un DSB se introduce en el genoma, la lesión del ADN se repara a través de dos vías que están universalmente presentes en casi todos los tipos de células y organismos: no homóloga se terminan uniendo (NHEJ) y dirigido por homología reparación (HDR)3,4 . La naturaleza imprecisa de la maquinaria NHEJ con frecuencia produce indels de varias longitudes5,6,7,8,9. Introducción de mutaciones del mutágeno ' frameshift ' en la secuencia de codificación de un gen puede producir un codón de parada prematuro, que a menudo hace que el gen no funcional.
Principios estrategias de ingeniería de genoma en el pez cebra para promover indels incluyen meganucleases, las nucleasas de dedos de zinc y nucleasas de efectoras como activador de transcripción, que utiliza las interacciones DNA proteína para una nucleasa para un específico de la genómica destino donde introdujo un DSB10,11,12,13,14,15. Sin embargo, estas tecnologías son a menudo difíciles de aplicar debido a la ingeniería laboriosa y complejo, necesaria para generar una nucleasa que dirige la secuencia de ADN de interés. A diferencia de estrategias anteriores, edición basada en CRISPR gene no depende de las interacciones DNA proteína para apuntar. En cambio, la endonucleasa CRISPR-asociado (Cas) se dirige a través de una guía de RNA que utiliza la base de interacciones de apareamiento de nucleótidos a un sitio de genómico de interés16,17,18,19 ,20,21. Debido a la simplicidad del diseño de un RNA guía con la base deseada vinculación interacciones para apuntarlo es relativamente fácil tratar la endonucleasa de Cas para el locus deseado. El tipo sistema de II CRISPR en particular ha sido ampliamente desarrollado para aplicaciones de edición de genoma debido a varias características ventajosas incluyendo el uso de una sola multidominio Cas nucleasa (Cas9) que requiere la interacción con el ADN para estimular la actividad de endonucleasa y uso de un guía única RNA (sgRNA) dirigirse al cognado de secuencia de ADN18. Los requisitos de la secuencia necesarios para atacar lo sgRNA cognado son bien entendido19y lo sgRNA deseada se genera fácilmente por en vitro de la transcripción. La sencillez y la solidez del enfoque CRISPR/Cas9 facilita enormemente la modificación genética dirigida en pez cebra y una amplia variedad de otros organismos.
La mayor capacidad a llevar a cabo la edición del genoma específica en el pez cebra como resultado de la elaboración de reactivos basados en CRISPR tiene significativamente mayor la oportunidad de estudiar procesos emblemáticos de organismos vertebrados tales como el desarrollo de la central nerviosa sistema. El genoma del pez cebra contiene ortólogos del 70% de los genes de codificación de la proteína encontrados el genoma humano así como el 84% de los genes asociados con enfermedades en los seres humanos22. Desarrollo del pez cebra presenta varias cualidades claves que potencian su uso en estudios genéticos reversos: los embriones se colocan en grandes garras, desarrollar desde el exterior de la madre lo que los hace susceptibles de genética manipulación por microinyección y pez cebra adulto sexualmente maduros por 3 meses de edad, lo que permite la propagación rápida de líneas deseada23.
Existen numerosos protocolos que describen una variedad de enfoques para generar e identificar derivados CRISPR indels en pez cebra24,25,26,27,28,29 ,30,31. Sin embargo, muchos de estos procedimientos son tiempo intensivo, requieren el acceso a equipos costosos y pueden ser un desafío para los laboratorios con limitados conocimientos. Los pasos descritos proporcionan una sencilla, robusta y económica CRISPR/Cas9 estrategia Ingeniero pez cebra nocaut líneas. Este protocolo describe el uso de un equipo altamente eficiente para sintetizar sgRNAs usando oligonucleótidos de DNA (oligos), similar a otros enfoques que han sido descritas32. El protocolo descrito incluye dos pasos en particular que simplifican grandemente el análisis de líneas CRISPR-transformado: paso a paso uso de HMA basada polimerización en cadena33 para determinar fácilmente la presencia de modificaciones del genoma y el análisis de la secuencia de pez cebra heterozigótico para rápida y fácilmente determinar la naturaleza de indels múltiples de una manera económica. Además, instrucciones paso a paso se incluyen para selección robusto, producción confiable y la inyección de guía RNAs. Los pasos indicados aquí son un ejemplo de un protocolo robusto, relativamente barato que permite que el personal de laboratorio con una gama de conocimientos contribuir a la identificación de los knockouts de genes en el pez cebra.
El objetivo general de este procedimiento es realizar una edición genómica dirigida utilizando la tecnología CRISPR/Cas9 en pez cebra para diseñar knockouts de genes de una manera robusta y económica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el papel biológico de un gen en el contexto de un sistema modelo de vertebrados, como la forma en que un gen contribuye a los procesos de desarrollo en eucariotas de orden superior. Con estos procedimientos simples y robustos, el personal de laboratorio de todos los niveles de experiencia, incluidos los estudiantes universitarios, puede realizar modificaciones genómicas específicas en el pez cebra.
Las personas nuevas en este método deben ser capaces de seguir las instrucciones paso a paso para identificar los objetivos genómicos óptimos para la mutagénesis CRISPR, realizar la microinyección de embriones de pez cebra e identificar alelos modificados. La demostración visual de este método es fundamental, ya que este método está destinado a estudiantes universitarios que pueden no estar familiarizados con una o más de las técnicas necesarias. En el protocolo de texto se proporcionan directrices para el diseño de oligonucleótidos específicos de plantilla para la producción de ARN guía.
Para empezar, suspenda la proteína Cas9 en tampón para generar una solución de un miligramo por mililitro. Almacene esta solución en alícuotas listas para inyección a menos 80 grados Celsius para su uso posterior. A continuación, sintetice el sgRNA con un kit de transcripción in vitro como el sugerido en los materiales de este artículo según las instrucciones del fabricante.
Purifique el sgRNA sintetizado utilizando una precipitación de acetato de amonio libre de ARNasa. Agregue 25 microlitros de acetato de amonio de cinco molares al ARN sintetizado y mezcle la solución por vórtice. A continuación, agregue 150 microlitros de etanol libre de nucleasa de 200 grados a la muestra.
Y coloque la reacción en un congelador a menos 80 grados centígrados durante al menos 20 minutos. A continuación, centrifugar las muestras a máxima velocidad. Utilice una pipeta para eliminar el sobrenadante teniendo cuidado de no alterar la bolita de ARN.
Luego agregue un mililitro de etanol al 70% e invierta el tubo varias veces para lavar la sal residual del tubo. Vuelva a centrifugar a velocidad máxima a cuatro grados centígrados durante siete minutos. Utilice una pipeta P1000 para eliminar la mayor parte de la solución.
A continuación, utilice una pipeta P200 para eliminar la mayor cantidad posible de la solución restante sin alterar el pellet. Teniendo cuidado de evitar la contaminación por ARNasa, seque el pellet en un espacio limpio hasta que no haya gotas de líquido visibles en el tubo. Vuelva a suspender el pellet en 30 microlitros de agua libre de ARNasa y utilice un espectrofotómetro para cuantificar el producto.
Alícuota la solución para el almacenamiento a largo plazo a menos 80 grados centígrados. A continuación, mezcle de 300 a 500 nanogramos de sgRNA con un volumen igual de tinte de carga en gel de ARN 2X. A continuación, con una pipeta P1000, limpie cada uno de los pocillos de gel de agarosa de residuos con tampón de funcionamiento varias veces.
Cargue las soluciones en los pocillos de gel de agarosa y haga funcionar el gel a 10 voltios por centímetro durante el tiempo suficiente para separar las bandas de ARN en el gel. El tiempo puede variar según el aparato de electroforesis. En general, el frente del tinte debe extenderse a 2/3 de la longitud del gel.
A continuación, utilice una tinción de ácido nucleico para visualizar las bandas. El ARN intacto aparece como una sola banda, como en los carriles uno y dos que se muestran aquí. El ARN degradado se ejecuta como un frotis, como en el carril tres.
Primero, prepare a los sujetos de pez cebra para la reproducción la noche anterior a realizar las inyecciones como se describe en el protocolo de texto. A continuación, combine la proteína Cas9 y el sgRNA en una proporción de dos a uno. Incubar la solución a temperatura ambiente durante cinco minutos mientras el Cas9 y el sgRNA forman un complejo de ribonucleoproteínas.
A continuación, añada 0,5 microlitros de soluciones de rojo de fenol al 2,5% en suficiente agua libre de ARNasa para alcanzar un volumen final de cinco microlitros. Para preparar la aguja de inyección, utilice un extractor de micropipetas para extraer un capilar de vidrio de un milímetro. A continuación, corte la punta de la aguja de vidrio resultante con una cuchilla de afeitar para obtener una abertura en ángulo.
Coloque la aguja en un micromanipulador conectado a un microinyector. Con un microscopio óptico, ajuste la presión de inyección hasta que la aguja inyecte constantemente un nanómetro de solución en la placa de Petri. Antes de realizar la microinyección de embriones, practique la preparación de agujas e inyecte embriones de control utilizando una solución de solo colorante y registre la supervivencia después de 24 horas de desarrollo.
Debería ser capaz de obtener una supervivencia superior al 90% en comparación con un control no inyectado. A continuación, seleccione de 10 a 15 embriones como población de control y colóquelos en una placa de Petri etiquetada por separado. Con una pipeta de transferencia, alinee cuidadosamente los embriones restantes en una placa de inyección a temperatura ambiente.
Bajo un microscopio de disección, inyecte un nanolitro de la solución en el saco vitelino de cada embrión. A continuación, devuelva los embriones inyectados a una placa de Petri etiquetada y cúbralos con 1X E3 medio con azul de metileno. Colocar los embriones inyectados en una incubadora a 28 grados centígrados durante 24 horas.
A continuación, inspeccione los embriones inyectados para eliminar los individuos muertos o con un desarrollo anormal. Primero, recoja dos conjuntos de cinco embriones de 72 horas de edad de las placas que contienen embriones inyectados y un juego de cinco embriones de 72 horas de edad del grupo de control no inyectado en los tubos de microcentrífuga. Pipetear suavemente los medios de cada conjunto de embriones y anestesiarlos.
Retire el anestésico después de dos minutos y agregue 45 microlitros de hidróxido de sodio de 50 milimolares. A continuación, incubar las muestras a 95 grados durante 10 minutos. A continuación, retire las muestras de la incubadora y deje que se enfríen a temperatura ambiente.
Añadir cinco microlitros de un plorhidrato molar de tris y vortear las muestras vigorosamente. A continuación, centrifugar la solución a máxima velocidad a temperatura ambiente durante tres minutos. Transfiera el sobrenadante que contiene el ADN genómico a un nuevo tubo marcado y almacene el ADNg a menos 20 grados Celsius.
Utilice los cebadores diseñados para amplificar alrededor de la región diana del sgRNA como se describe en el texto para amplificar un fragmento de PCR para el análisis heterodúplex. Utilice un kit de limpieza de PCR para purificar los productos de la reacción de PCR. Diluya las muestras en 30 microlitros de agua y utilice un espectrofotómetro para cuantificar el ADN.
Coloque los tubos que contienen los amplicones de PCR en una rejilla flotante en un baño de agua hirviendo. A continuación, prepare un gel TBE de poliacrilamida al 15% con un 30% de poliacrilamida. Después de que el gel se fije, colóquelo en un aparato de electroforesis con tampón de funcionamiento TBE.
A continuación, cargue 500 nanogramos de los productos de PCR recocidos y cargue un control junto a cada conjunto de muestras de sgRNA. Enciende el gel a 150 voltios durante dos horas y media o hasta que el frente del tinte esté en el fondo del gel. Crecen embriones de pez cebra inyectados hasta la edad adulta que muestran bandas heterodúplex en el HMA.
Para interpretar el HMA, compare la intensidad de la banda homodúplex de la PCR del control no inyectado de tipo salvaje con las muestras inyectadas correspondientes. Si se ha producido un corte suficiente, la intensidad de la banda de los peces inyectados debe ser aproximadamente un 50% más baja que la del control de tipo salvaje. Para confirmar la presencia de indels en posibles peces padres fundadores, anestesiar al pez con tricaína al 0,004% y utilizar una cuchilla de afeitar limpia para eliminar de 1/2 a 3/4 de la aleta caudal.
Luego, coloque la cola en 45 microlitros de hidróxido de sodio de 50 milimolares. Regrese el pez a un tanque de recuperación y realice la extracción de ADNg como se describió anteriormente. A continuación, realice un HMA en el ADNg de la pinza de cola para determinar si el individuo fue modificado con éxito por la inyección de CRISPR.
Luego, cría los adultos que exhiben bandas heterodúplex en el ADN de la cola con peces de tipo salvaje. Seleccione el pez fundador para generar peces F1 en función del análisis de HMA de los estanques. Finalmente, secuenciar el ADNg del pez de interés para caracterizar la naturaleza del indel.
Tras el éxito de la producción y microinyección de reactivos CRISPR, se analizaron los embriones de pez cebra para determinar los fenotipos manifiestos y la formación de indel mediante HMA. La formación de indel indel inducida por Cas9 en la tirosinasa da lugar a la pérdida de pigmentación y se obtiene fácilmente 48 horas después de la fertilización. La identificación de alelos modificados con CRISPR que no dan lugar a fenotipos de desarrollo manifiestos se realiza mediante HMA.
La focalización exitosa del gen de interés da como resultado la formación de bandas heterodúplex y la reducción de la intensidad de la banda homodúplex, como en los carriles tres y cuatro. No olvides que trabajar con un organismo vertebrado conlleva responsabilidades éticas. Este protocolo describe estrategias que minimizan el número de peces cebra necesarios para obtener un knockout, un objetivo que debe tenerse en cuenta al realizar este procedimiento.
Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para generar e identificar rápidamente el pez cebra portador de alelos modificados con CRISPR que se transmitirán en la línea germinal con alta eficiencia. Es importante destacar que esta técnica se ha optimizado para ser un enfoque de bajo costo accesible para estudiantes universitarios y otras personas con poca experiencia previa. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar e implementar fácilmente un enfoque de eliminación de genes basado en CRISPR utilizando pez cebra.