שימור מכונות מולקולריות על פני פרוקריוטים ביסוד בכוח באמצעות מודל אורגניזמים למחקר. רבות ממערכות אלה דגם להקל על השימוש של גישות הפוכה-גנטית כמו ג'ין יישוב הסתרה כדי לאפיין את התרומה של מוצר ג'ין לתהליך ביולוגי או מחלה של ריבית. טכניקות שיבוש גנטי אורגניזמים כגון דג זברה יש היסטורית הסתמך על יישוב מבוא של מוטציות frameshift הנובעים תיקון מדויק של DSBs1,2. כאשר DSB מוחדרים הגנום, הנגע DNA יתוקן בזו של שני המסלולים הקיימים אוניברסלית כמעט כל סוגי תאים ואורגניזמים: קצה שאינם הומולוגיים להצטרף (NHEJ) ותיקון מכוון הומולוגיה (HDR)3,4 . הטבע מדויק של מכונות NHEJ מייצרת לעתים קרובות indels השונים אורכים5,6,7,8,9. הקדמה של frameshift מוטציות ברצף קידוד של גנים יכול לייצר codon עצירה מוקדמת, אשר לעתים קרובות הופך את הגן מתפקד.
מוקדם אסטרטגיות הנדסיות הגנום דג זברה כדי לקדם את indels כולל meganucleases nucleases אבץ-אצבע, תמלול אפקטור activator דמוי nucleases, אשר מנוצל אינטראקציות חלבון-דנ א למטרה של נוקלאז מסוים גנומית היעד שבו הוא הציג DSB10,11,12,13,14,15. עם זאת, טכנולוגיות אלה לעיתים קרובות קשה להחיל עקב ההנדסה מייגעת ומורכבת הדרושים כדי ליצור נוקלאז שמכוונת את רצף ה-DNA של עניין. בניגוד אסטרטגיות הקודם, ג'ין מבוססי CRISPR עריכה לא להסתמך על אינטראקציות חלבון-DNA עבור מיקוד. במקום זאת, endonuclease הקשורים CRISPR (Ca) מכוונת דרך מדריך RNA המשתמשת נוקלאוטיד הבסיס זיווג אינטראקציות למטרה אתר גנומית של ריבית16,17,18,19 20, ,21. בגלל הפשטות של עיצוב של RNA מדריך עם הבסיס הרצוי זיווג אינטראקציות הכוונת זה קל יחסית למקד את endonuclease Cas על מיקומה הרצוי. הסוג השני CRISPR מערכת בפרט נרחב פותחה עבור יישומים לעריכת הגנום עקב מספר תכונות יתרון כולל שימוש יחיד וחשבונות קס נוקלאז (Cas9) שדורש אינטראקציה עם ה-DNA כדי לעורר פעילות endonuclease שימוש RNA מדריך יחיד (sgRNA) כדי להגדירה על רצף ה-DNA cognate18. הדרישות רצף הכרחי עבור פילוח של sgRNA cognate ובכן מובן19, sgRNA הרצוי נוצר בקלות על ידי שעתוק במבחנה . הפשטות ואת החוסן של הגישה CRISPR/Cas9 מאוד מקל שינוי גנטי יישוב בדג זברה ועוד מגוון רחב של אורגניזמים אחרים.
היכולת המשופרת מתחייב הגנום יישוב עריכה בדג זברה בעקבות פיתוח ריאגנטים מבוססי CRISPR יש באופן משמעותי גדל הזדמנות ללמוד תהליכים הסמלי של אורגניזמים חוליות כגון התפתחות המרכזי עצבני מערכת. הגנום דג זברה מכיל orthologs של 70% של גנים חלבונים הנמצאים את הגנום האנושי, כמו גם 84% של גנים הקשורים במחלות בני22. דג זברה פיתוח מוצגים מספר האיכויות מפתח המשפרים את השימוש בו מחקרים גנטיים הפוכה: העוברים הונחו ב וזעקה גדולה, לפתח חיצוני מהאם הפיכתם מניפולציה נוטה גנטי על ידי microinjection, דג זברה למבוגרים בוגרת מינית על ידי 3 חודשים של גיל, המאפשר התפשטות מהירה של השורות הרצוי23.
פרוטוקולים רבים זמינים המתארים את מגוון של גישות להפיק ולזהות נגזר CRISPR indels דג זברה24,25,26,27,28,29 30, ,31. עם זאת, רבים של הליכים אלה הן זמן אינטנסיבי, דורשים גישה לציוד יקר, עשויה להיות מאתגרת עבור מעבדות עם מומחיות מוגבלת. השלבים המתוארים בזאת מספקים פשוט, עמיד וחסכוני CRISPR/Cas9-אסטרטגיה לקווים נוקאאוט של מהנדס דג זברה. פרוטוקול זה מתאר את השימוש ערכה יעילה במיוחד לסנתז sgRNAs באמצעות DNA oligonucleotides (oligos), בדומה גישות אחרות שהיו בעבר תיאר32. הפרוטוקול המתואר כולל שני שלבים בפרט במידה רבה לפשט ניתוח של מוטציה CRISPR קווים: השימוש HMA מבוססי ה-PCR33 בקלות לקבוע הנוכחות של הגנום שינויים, וניתוח רצף של צעד אחר צעד דג זברה משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים במהירות ובקלות לקבוע את אופי indels מרובות בצורה חסכונית. בנוסף, הוראות שלב אחר שלב כלולים עבור ובחירת חזקים, יצור אמינים, הזרקה של מדריך RNAs. השלבים שסופק כאן להדגים פרוטוקול חזקות, זולה יחסית המאפשרת עובדי מעבדה עם מגוון של התמחויות לתרום לזיהוי של ג'ין הסתרה של דג זברה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע עריכת גנום ממוקדת באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9 בדגי זברה כדי להנדס נוקאאוטים גנטיים בצורה חזקה וזולה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי התפקיד הביולוגי של גן בהקשר של מערכת מודל של בעלי חוליות, כגון כיצד גן תורם לתהליכי התפתחות באיקריוטים מסדר גבוה יותר. בעזרת הליכים חזקים ופשוטים אלה, אנשי מעבדה בכל רמות הניסיון כולל סטודנטים לתואר ראשון יכולים לבצע שינויים גנומיים ממוקדים בדגי הזברה.
אנשים חדשים בשיטה זו צריכים להיות מסוגלים לעקוב אחר ההוראות שלב אחר שלב כדי לזהות מטרות גנומיות אופטימליות למוטגנזה של CRISPR, לבצע מיקרו-הזרקה של עוברי דג זברה ולזהות אללים ששונו. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית מכיוון ששיטה זו מיועדת לסטודנטים לתואר ראשון שאולי אינם מכירים אחת או יותר מהטכניקות הדרושות. הנחיות לעיצוב אוליגואים ספציפיים לתבנית לייצור RNA מנחה מסופקות בפרוטוקול הטקסט.
כדי להתחיל, השעו את חלבון Cas9 במאגר כדי ליצור תמיסה של מיליגרם אחד למיליליטר. אחסן תמיסה זו בכמויות מוכנות להזרקה במינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. לאחר מכן סנתז את ה-sgRNA עם ערכת שעתוק במבחנה כמו זו המוצעת בחומרים של מאמר זה לפי הוראות היצרן.
טהר את ה-sgRNA המסונתז באמצעות משקעי אמוניום אצטט ללא RNAse. הוסף 25 מיקרוליטר של חמישה אמוניום אצטט מולארי ל-RNA המסונתז וערבב את התמיסה על ידי מערבולת. לאחר מכן, הוסף לדגימה 150 מיקרוליטר של 200 אתנול נטול נוקלאז הוכחה.
ומניחים את התגובה במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימות במהירות מרבית. השתמש בפיפטה כדי להסיר את הסופרנטנט תוך הקפדה לא להפריע לכדור ה-RNA.
לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של אתנול 70% והפוך את הצינור מספר פעמים כדי לשטוף שאריות מלח מהצינור. שוב צנטריפוגה במהירות מקסימלית בארבע מעלות צלזיוס למשך שבע דקות. השתמש בפיפטה P1000 כדי להסיר את רוב התמיסה.
לאחר מכן השתמש בפיפטה P200 כדי להסיר כמה שיותר מהתמיסה שנותרה מבלי להפריע לגלולה. הקפידו להימנע מזיהום RNAse, יבשו את הגלולה בחלל נקי עד שלא נראו טיפות נוזלים בצינור. השעו מחדש את הגלולה ב-30 מיקרוליטר מים נטולי RNAse והשתמשו בספקטרופוטומטר כדי לכמת את המוצר.
Aliquot הפתרון לאחסון לטווח ארוך במינוס 80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן מערבבים 300 עד 500 ננוגרם של sgRNA עם נפח שווה של צבע טעינת ג'ל RNA פי 2. לאחר מכן, בעזרת פיפטה P1000, נקה כל אחת מבארות ג'ל האגרוז מפסולת עם חיץ פועל מספר פעמים.
טען את התמיסות לבארות הג'ל של אגרוז והפעל את הג'ל ב-10 וולט לסנטימטר למשך זמן מספיק כדי להפריד את רצועות ה-RNA על הג'ל. הזמן עשוי להשתנות בהתאם למכשיר האלקטרופורזה. באופן כללי, יש להפעיל את חזית הצבע עד 2/3 שניות מאורך הג'ל.
לאחר מכן השתמש בכתם חומצת גרעין כדי לדמיין את הרצועות. RNA שלם מופיע כרצועה אחת כמו בנתיב הראשון והשני המוצגים כאן. RNA מושפל פועל כמריחה כמו בנתיב שלוש.
ראשית, הכינו את נבדקי דג הזברה לרבייה בלילה שלפני ביצוע הזריקות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן שלב חלבון Cas9 ו-sgRNA ביחס של שניים לאחד. דגרו את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות בזמן שה-Cas9 וה-sgRNA יוצרים קומפלקס ריבונוקלאופרוטאין.
לאחר מכן הוסף 0.5 מיקרוליטר של תמיסות אדומות פנול 2.5% במים נטולי RNAse בכמות מספקת כדי להשיג נפח סופי של חמישה מיקרוליטר. כדי להכין את מחט ההזרקה, השתמש במושך מיקרופיפטה כדי למשוך נימי זכוכית של מילימטר אחד. לאחר מכן חותכים את קצה מחט הזכוכית המתקבלת בעזרת סכין גילוח כדי לקבל פתח זוויתי.
הנח את המחט במיקרומניפולטור המחובר למיקרו-מזרק. בעזרת מיקרוסקופ אור, כוונן את לחץ ההזרקה עד שהמחט תזריק באופן עקבי ננומטר אחד של תמיסה בצלחת הפטרי. לפני ביצוע הזרקת מיקרו לעוברים, תרגלו הכנת מחטים והזרקת עוברי ביקורת באמצעות תמיסת צבע בלבד ורשמו את ההישרדות לאחר 24 שעות של התפתחות.
אתה אמור להיות מסוגל להשיג הישרדות גדולה מ-90% בהשוואה לביקורת ללא הזרקה. לאחר מכן, בחרו 10 עד 15 עוברים כאוכלוסיית ביקורת והניחו אותם בצלחת פטרי נפרדת. בעזרת פיפטת העברה, מסדרים בזהירות את העוברים הנותרים על צלחת הזרקה בטמפרטורת החדר.
תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הזרקו ננו-ליטר אחד מהתמיסה לשק החלמון של כל עובר. לאחר מכן החזירו את העוברים שהוזרקו לצלחת פטרי מסומנת וכסו אותם במדיה 1X E3 עם מתילן כחול. מניחים את העוברים המוזרקים באינקובטור בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
לאחר מכן בדוק את העוברים המוזרקים כדי להסיר פרטים מתים או מתפתחים בצורה חריגה. ראשית, אספו שתי קבוצות של חמישה עוברים בני 72 שעות מהצלחות המכילות עוברים שהוזרקו וקבוצה אחת של חמישה עוברים בני 72 שעות מקבוצת הביקורת שלא הוזרקה לתוך צינורות המיקרו-צנטריפוגה. יש להוציא בעדינות את המדיה מכל סט עוברים ולהרדים אותם.
הסר את חומר ההרדמה לאחר שתי דקות והוסף 45 מיקרוליטר של 50 מילי-מולרי נתרן הידרוקסיד. לאחר מכן דגרו את הדגימות ב-95 מעלות למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוציאו את הדגימות מהחממה והניחו להן להתקרר לטמפרטורת החדר.
הוסף חמישה מיקרוליטרים של pH מולארי אחד טריס הידרוכלוריד ומערבל את הדגימות במרץ. ואז צנטריפוגה את התמיסה במהירות מקסימלית בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות. העבירו את הסופרנטנט המכיל את ה-DNA הגנומי לצינור חדש עם תווית ואחסנו את ה-gDNA במינוס 20 מעלות צלזיוס.
השתמש בפריימרים שנועדו להגביר סביב אזור היעד sgRNA כמתואר בטקסט כדי להגביר שבר PCR לניתוח הטרודופלקס. השתמש בערכת ניקוי PCR כדי לטהר את תוצרי תגובת ה-PCR. יש לדלל את הדגימות ב-30 מיקרוליטר מים ולהשתמש בספקטרופוטומטר כדי לכמת את ה-DNA.
הנח את הצינורות המכילים את מגפי ה-PCR במתלה צף באמבט מים רותחים. לאחר מכן הכינו ג'ל TBE 15% פוליאקרילאמיד באמצעות 30% פוליאקרילאמיד. לאחר שהג'ל מתייצב, הנח אותו במנגנון אלקטרופורזה עם מאגר פועל TBE.
לאחר מכן טען 500 ננוגרם של מוצרי ה-PCR המחושלים וטען בקרה ליד כל קבוצה של דגימות sgRNA. הפעל את הג'ל על 150 וולט למשך שעתיים וחצי או עד שחזית הצבע נמצאת בתחתית הג'ל. גדל עוברי דג זברה מוזרקים לבגרות המראים רצועות הטרודופלקס ב- HMA.
כדי לפרש את ה-HMA, השווה את עוצמת רצועת ההומודופלקס מה-PCR של הבקרה הלא מוזרקת מסוג הבר לדגימות המוזרקות המתאימות. אם התרחש חיתוך מספיק, עוצמת הרצועה מהדג המוזרק צריכה להיות נמוכה בכ-50% מבקרת סוג הבר. כדי לאשר את נוכחותם של אינדליים בדגי אב מייסדים פוטנציאליים, הרדימו את הדג ב-0.004% טריקאין והשתמשו בסכין גילוח נקי כדי להסיר 1/2 עד 3/4 מסנפיר הזנב.
לאחר מכן, הניחו את הזנב ב-45 מיקרוליטר של נתרן הידרוקסיד 50 מילי-מולרי. החזר את הדג למיכל התאוששות ובצע את מיצוי ה-gDNA כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, בצע HMA על קליפ הזנב gDNA כדי לקבוע אם האדם שונה בהצלחה על ידי הזרקת CRISPR.
לאחר מכן לגדל את הבוגרים המציגים רצועות הטרודופלקס ב-DNA של הזנב לדגים מסוג בר. בחר דגי מייסד ליצירת דגי F1 על סמך ניתוח HMA של בריכות. לבסוף, רצף את ה-gDNA של הדג המעניין כדי לאפיין את טבעו של האינדל.
לאחר ייצור מוצלח ומיקרו-הזרקה של ריאגנטים של CRISPR, עוברי דג הזברה נותחו לפנוטיפים גלויים והיווצרות אינדל באמצעות HMA. היווצרות אינדל המושרה על ידי Cas9 בטירוזינאז גורמת לאובדן פיגמנטציה והיא ניקוד בקלות עד 48 שעות לאחר ההפריה. זיהוי אללים שעברו שינוי ב-CRISPR שאינם גורמים לפנוטיפים התפתחותיים גלויים מתבצע באמצעות HMA.
מיקוד מוצלח של הגן המעניין מביא להיווצרות רצועות הטרודופלקס ולהפחתת עוצמת הפס ההומודופלקס כמו בנתיבים 3 ו-4. אל תשכח שעבודה עם אורגניזם בעל חוליות נושאת אחריות אתית. פרוטוקול זה מתאר אסטרטגיות הממזערות את מספר דגי הזברה הדרושים להשגת נוקאאוט, מטרה שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע הליך זה.
לאחר השליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי ליצור ולזהות במהירות דגי זברה הנושאים אללים שעברו CRISPR שיועברו בקו הנבט ביעילות גבוהה. חשוב לציין, טכניקה זו עברה אופטימיזציה כדי להיות גישה בעלות נמוכה המתאימה לסטודנטים לתואר ראשון ואחרים עם מעט ניסיון קודם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לתכנן וליישם בקלות גישת נוקאאוט גנטית מבוססת CRISPR באמצעות דג הזברה.