La conservazione di macchine molecolari attraverso eucarioti sottende il potere di utilizzare organismi modello per la ricerca. Molti di questi sistemi modello facilitare l'uso di approcci di genetica inversa come TNA knockouts genica mirata a caratterizzare il contributo di un prodotto del gene di un processo biologico o malattia di interesse. Tecniche di rottura del gene in organismi come zebrafish hanno storicamente invocata Introduzione mirata di mutazioni frameshift che derivano da riparazione imprecisa di DSBs1,2. Quando un DSB è stato introdotto nel genoma, la lesione del DNA è riparata attraverso una delle due vie che sono universalmente presenti in quasi tutti i tipi di cellule e organismi: non-omologo fine unirsi (NHEJ) e riparazione omologia-diretto (HDR)3,4 . L'imprecisione del macchinario NHEJ produce frequentemente indels di varie lunghezze5,6,7,8,9. Introduzione di mutazioni frameshift nella sequenza di codificazione di un gene in grado di produrre un codone di stop prematuro, che spesso rende il gene non funzionali.
Strategie di ingegneria genoma iniziali in zebrafish per promuovere indels includono meganucleases, nucleasi a dita di zinco e nucleasi di attivatore-come effettore trascrizione, tutti di cui utilizzato interazioni della DNA-proteina per impostare come destinazione una nucleasi a uno specifico genomica destinazione dove ha introdotto un DSB10,11,12,13,14,15. Tuttavia, queste tecnologie sono spesso difficili da applicare a causa la laboriosa e complessa ingegneria necessaria per generare una nucleasi che rivolge la sequenza di DNA di interesse. A differenza delle precedenti strategie, basate su CRISPR gene editing non si basa su interazioni proteina-DNA per il targeting. Invece, l'endonucleasi CRISPR-collegata (Cas) sono diretto tramite una guida di RNA che utilizza del nucleotide base pairing interazioni di destinare un sito genomico di interesse16,17,18,19 ,20,21. Grazie alla semplicità di progettazione di un RNA guida con la base desiderata interazioni per bersagliandola di accoppiamento è relativamente facile per indirizzare l'endonucleasi di Cas per il luogo desiderato. Il tipo sistema di II CRISPR in particolare è stato ampiamente sviluppato per applicazioni di editing del genoma a causa di diverse caratteristiche vantaggiose, compreso l'uso di una singola nucleasi Cas multidominio (Cas9) che richiede l'interazione con il DNA per stimolare attività endonucleasica e uso di una singola guida RNA (sgRNA) per scegliere come target e le cognate di sequenza di DNA18. I requisiti di sequenza necessari per il targeting del sgRNA cognata sono ben compreso19, e il sgRNA desiderato è facilmente generato da trascrizione in vitro . La semplicità e la robustezza dell'approccio CRISPR/Cas9 facilita enormemente la modificazione genetica mirata in zebrafish e una vasta gamma di altri organismi.
La maggiore capacità di intraprendere l'editing genomico mirato in zebrafish come risultato lo sviluppo di reagenti a base CRISPR ha significativamente aumentato la possibilità di studiare processi emblematici di organismi vertebrati come sviluppo del sistema nervoso centrale sistema. Il genoma di zebrafish contiene ortologhi del 70% dei geni codificanti per proteine trovati il genoma umano, nonché l'84% dei geni associati a malattie in esseri umani22. Zebrafish sviluppo esibisce parecchie qualità chiave che migliorano l'utilizzo in studi di genetica inverso: gli embrioni vengono deposte in grandi frizioni, sviluppano esternamente dalla madre che li rende suscettibili di genetica manipolazione di microiniezione e zebrafish adulto sessualmente maturi entro 3 mesi dell'età, permettendo per propagazione rapida di righe desiderate23.
Sono disponibili numerosi protocolli che descrivono una varietà di approcci per generare e identificare CRISPR-derivato indels in zebrafish24,25,26,27,28,29 ,30,31. Tuttavia, molte di queste procedure sono tempo intensivo, richiedono l'accesso all'apparecchiatura costosa e può essere difficile per i laboratori con limitata esperienza in campo. I passaggi descritti nel presente documento forniscono una semplice, robusta ed economica CRISPR/Cas9-strategia per ingegnere zebrafish knockout linee. Questo protocollo descrive l'uso di un kit altamente efficiente per sintetizzare sgRNAs usando i oligonucleotides del DNA (oligos), simile ad altri approcci che sono stati precedentemente descritto32. Il protocollo descritto include due passaggi in particolare che semplificano notevolmente l'analisi delle linee CRISPR-mutato: dettagliata uso della PCR-basata HMA33 determinare facilmente la presenza di modificazioni del genoma e l'analisi di sequenziamento di eterozigote zebrafish rapidamente e facilmente determinare la natura di più indels in modo economico. Inoltre, le istruzioni dettagliate sono incluse per selezione robusto, affidabile produzione e iniezione di guida RNAs. I passaggi descritti qui esemplificano un protocollo robusto, relativamente poco costoso che permette al personale di laboratorio con una gamma di competenze contribuire all'identificazione dei Ko del gene in zebrafish.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di eseguire l'editing mirato del genoma utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9 nel pesce zebra per ingegnerizzare i knockout genici in modo robusto ed economico. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sul ruolo biologico di un gene nel contesto di un sistema modello di vertebrati, come ad esempio il modo in cui un gene contribuisce ai processi di sviluppo negli eucarioti di ordine superiore. Con queste semplici e robuste procedure, il personale di laboratorio di tutti i livelli di esperienza, compresi gli studenti universitari, può eseguire modifiche genomiche mirate nel pesce zebra.
Gli individui che non conoscono questo metodo dovrebbero essere in grado di seguire le istruzioni passo dopo passo per identificare i bersagli genomici ottimali per la mutagenesi CRISPR, eseguire la microiniezione di embrioni di zebrafish e identificare gli alleli modificati. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto questo metodo è destinato agli studenti universitari che potrebbero non avere familiarità con una o più delle tecniche necessarie. Le linee guida per la progettazione di oligo specifici per la produzione di RNA guida sono fornite nel protocollo di testo.
Per iniziare, sospendere la proteina Cas9 nel tampone per generare una soluzione di un milligrammo per millilitro. Conservare questa soluzione in aliquote pronte per l'iniezione a meno 80 gradi Celsius per un uso successivo. Quindi sintetizzare l'sgRNA con un kit di trascrizione in vitro come quello suggerito nei materiali di questo articolo secondo le istruzioni del produttore.
Purificare l'sgRNA sintetizzato utilizzando una precipitazione di acetato di ammonio privo di RNAsi. Aggiungere 25 microlitri di acetato di ammonio a cinque molari all'RNA sintetizzato e mescolare la soluzione mediante vortex. Quindi, aggiungere al campione 150 microlitri di etanolo privo di nucleasi 200 proof.
E metti la reazione in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per almeno 20 minuti. Successivamente, centrifugare i campioni alla massima velocità. Utilizzare una pipetta per rimuovere il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet di RNA.
Quindi aggiungere un millilitro di etanolo al 70% e capovolgere il tubo più volte per lavare il sale residuo dal tubo. Centrifugare nuovamente alla massima velocità a quattro gradi Celsius per sette minuti. Utilizzare una pipetta P1000 per rimuovere la maggior parte della soluzione.
Quindi, utilizzare una pipetta P200 per rimuovere la maggior parte della soluzione rimanente senza disturbare il pellet. Facendo attenzione a evitare la contaminazione da RNAsi, asciugare il pellet in un luogo pulito fino a quando non ci sono gocce di liquido visibili nel tubo. Risospendere il pellet in 30 microlitri di acqua priva di RNAsi e quantificare il prodotto con uno spettrofotometro.
Aliquot la soluzione per la conservazione a lungo termine a meno 80 gradi Celsius. Quindi mescolare da 300 a 500 nanogrammi di sgRNA con un volume uguale di colorante caricante su gel di RNA 2X. Quindi, utilizzando una pipetta P1000, ripulire più volte ciascuno dei pozzetti di gel di agarosio dai detriti con il tampone di scorrimento.
Caricare le soluzioni nei pozzetti del gel di agarosio e far scorrere il gel a 10 volt per centimetro per un tempo sufficiente a separare le bande di RNA sul gel. Il tempo può variare a seconda dell'apparecchio per elettroforesi. In generale, il fronte del colorante dovrebbe essere fatto scorrere a 2/3 della lunghezza del gel.
Quindi usa una macchia di acido nucleico per visualizzare le bande. L'RNA intatto appare come una singola banda, come nelle corsie uno e due mostrate qui. L'RNA degradato viene eseguito come uno striscio, come nella corsia tre.
Per prima cosa, preparare i soggetti zebrafish per la riproduzione la notte prima di eseguire le iniezioni come descritto nel protocollo di testo. Quindi combina la proteina Cas9 e l'sgRNA in un rapporto di due a uno. Incubare la soluzione a temperatura ambiente per cinque minuti mentre il Cas9 e l'sgRNA formano un complesso ribonucleoproteico.
Quindi aggiungere 0,5 microlitri di soluzioni di rosso fenolo al 2,5% in una quantità sufficiente di acqua priva di RNAsi per ottenere un volume finale di cinque microlitri. Per preparare l'ago per iniezione, utilizzare un estrattore per micropipette per estrarre un capillare di vetro da un millimetro. Quindi tagliare la punta dell'ago di vetro risultante con una lama di rasoio per ottenere un'apertura angolata.
Posizionare l'ago in un micromanipolatore collegato a un microiniettore. Utilizzando un microscopio ottico, regolare la pressione di iniezione fino a quando l'ago non inietta costantemente un nanometro di soluzione nella capsula di Petri. Prima di eseguire la microiniezione di embrioni, esercitati a preparare gli aghi e a iniettare gli embrioni di controllo utilizzando una soluzione di solo colorante e registra la sopravvivenza dopo 24 ore dallo sviluppo.
Dovrebbe essere in grado di ottenere una sopravvivenza superiore al 90% rispetto a un controllo non iniettato. Successivamente, seleziona da 10 a 15 embrioni come popolazione di controllo e mettili in una capsula di Petri etichettata separata. Utilizzando una pipetta di trasferimento, allineare con cura gli embrioni rimanenti su una piastra per iniezione a temperatura ambiente.
Sotto un microscopio da dissezione, iniettare un nanolitro di soluzione nel sacco vitellino di ciascun embrione. Quindi rimetti gli embrioni iniettati in una capsula di Petri etichettata e coprili con terreno 1X E3 con blu di metilene. Metti gli embrioni iniettati in un'incubatrice a 28 gradi Celsius per 24 ore.
Quindi ispezionare gli embrioni iniettati per rimuovere gli individui morti o in sviluppo anomalo. Per prima cosa, raccogli due serie di cinque embrioni di 72 ore dalle piastre contenenti embrioni iniettati e una serie di cinque embrioni di 72 ore dal gruppo di controllo non iniettato nelle provette della microcentrifuga. Pipettare delicatamente il terreno da ogni set di embrioni e anestetizzarli.
Rimuovere l'anestetico dopo due minuti e aggiungere 45 microlitri di idrossido di sodio da 50 millimolari. Quindi incubare i campioni a 95 gradi per 10 minuti. Quindi, rimuovere i campioni dall'incubatore e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente.
Aggiungere cinque microlitri di tris cloridrato a pH molare e agitare vigorosamente i campioni. Quindi centrifugare la soluzione alla massima velocità a temperatura ambiente per tre minuti. Trasferire il surnatante che contiene il DNA genomico in una nuova provetta marcata e conservare il gDNA a meno 20 gradi Celsius.
Utilizzare i primer progettati per amplificare intorno alla regione target dell'sgRNA come descritto nel testo per amplificare un frammento PCR per l'analisi eteroduplex. Utilizzare un kit di pulizia PCR per purificare i prodotti della reazione PCR. Diluire i campioni in 30 microlitri di acqua e utilizzare uno spettrofotometro per quantificare il DNA.
Collocare le provette contenenti gli ampliconi per PCR in una rastrelliera galleggiante a bagnomaria bollente. Successivamente, preparare un gel TBE di poliacrilammide al 15% utilizzando il 30% di poliacrilammide. Dopo che il gel si è solidificato, inserirlo in un apparecchio per elettroforesi con tampone di corsa in TBE.
Quindi caricare 500 nanogrammi di prodotti PCR ricotti e caricare un controllo accanto a ciascun set di campioni di sgRNA. Far funzionare il gel a 150 volt per due ore e mezza o fino a quando il fronte del colorante non si trova sul fondo del gel. Crescere embrioni di pesce zebra iniettati fino all'età adulta che mostrano bande eteroduplex nell'HMA.
Per interpretare l'HMA, confrontare l'intensità della banda omoduplex dalla PCR del controllo non iniettato wild type con i corrispondenti campioni iniettati. Se si è verificato un numero sufficiente di tagli, l'intensità della banda del pesce iniettato deve essere inferiore di circa il 50% rispetto al controllo di tipo selvatico. Per confermare la presenza di indels nei potenziali pesci genitori fondatori, anestetizzare il pesce in tricaina allo 0,004% e utilizzare una lama di rasoio pulita per rimuovere da 1/2 a 3/4 della pinna caudale.
Quindi, posizionare la coda in 45 microlitri di idrossido di sodio da 50 millimolari. Rimettere il pesce in una vasca di recupero ed eseguire l'estrazione del gDNA come descritto in precedenza. Successivamente, eseguire un HMA sul gDNA della clip della coda per determinare se l'individuo è stato modificato con successo dall'iniezione di CRISPR.
Quindi allevare gli adulti che mostrano bande eteroduplex nel DNA della coda in pesci di tipo selvatico. Seleziona il pesce fondatore per generare il pesce F1 in base all'analisi HMA dei pool. Infine, sequenziare il gDNA del pesce di interesse per caratterizzare la natura dell'indel.
Dopo il successo della produzione e della microiniezione di reagenti CRISPR, gli embrioni di zebrafish sono stati analizzati per fenotipi evidenti e formazione di indel utilizzando HMA. La formazione di indel indotta da Cas9 alla tirosinasi provoca la perdita di pigmentazione ed è facilmente valutabile entro 48 ore dalla fecondazione. L'identificazione degli alleli modificati con CRISPR che non determinano fenotipi di sviluppo evidenti viene eseguita utilizzando HMA.
Il successo del targeting del gene di interesse provoca la formazione di bande eteroduplex e la riduzione dell'intensità della banda omoduplex, come nelle corsie tre e quattro. Non dimenticate che lavorare con un organismo vertebrato comporta responsabilità etiche. Questo protocollo descrive strategie che riducono al minimo il numero di zebrafish necessari per ottenere un knockout, un obiettivo che dovrebbe essere preso in considerazione durante l'esecuzione di questa procedura.
Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere utilizzata per generare e identificare rapidamente il pesce zebra che trasporta alleli modificati CRISPR che verranno trasmessi nella linea germinale con elevata efficienza. È importante sottolineare che questa tecnica è stata ottimizzata per essere un approccio a basso costo adatto a studenti universitari e altri con poca esperienza precedente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come progettare e implementare facilmente un approccio di knockout genico basato su CRISPR utilizzando zebrafish.