真核生物の分子機械の保全研究のためのモデル有機体の使用の力の基礎となります。これらのモデルのシステムの多くは興味の生物学的または病気プロセスに遺伝子産物の貢献を特徴付けるための目標とされた遺伝子ノックアウトなど逆遺伝学的アプローチの使用を促進します。ゼブラフィッシュなど生物の遺伝子破壊技術は、Dsb1,2の不正確な修理に起因するフレーム シフト変異のターゲット導入に頼ってきました。ゲノムに、DSB を導入すると、ほぼすべてのセル型の生物に普遍的に存在する 2 つの経路のいずれかを介して DNA 損傷は修復: 非相同末端結合 (NHEJ) と相同性向け修理 (HDR)3,4.NHEJ 機械の不正確な性質はよく様々 な長さ5,6,7,8,9オクターリピートを生成します。遺伝子のコーディング シーケンスのフレーム シフト変異の導入は、しばしばレンダリング遺伝子が機能しない時期尚早停止コドンを作り出すことができます。
すべての利用対象とする特定のゲノムにヌクレアーゼ DNA 蛋白質の相互作用、転写活性化因子のようなエフェクター核酸、亜鉛指核酸 meganucleases オクターリピートを促進するゼブラフィッシュの初期のゲノム工学戦略が含まれてターゲットそれは DSB10、11,12,13,14,15を導入します。しかし、これらの技術は興味の DNA シーケンスを対象とするヌクレアーゼを生成するために必要な骨の折れると複雑な工学のために適用することは困難で、しばしば。以前の戦略とは異なり CRISPR 遺伝子編集に依存しないターゲット蛋白質 DNA の相互作用。興味16,17,18,19 のゲノムのサイトを対象とする塩基対形成相互作用が基本を使用して RNA ガイドを介して CRISPR 関連 (Cas) エンドヌクレアーゼを指示する代わりに、 ,20,21。RNA のデザインのシンプルさのためガイド目的ベースの対形成相互作用それの対象とは、目的の軌跡に Cas エンドヌクレアーゼを対象とする比較的簡単です。タイプ II CRISPR システム特に広く培われた a エンドヌクレアーゼ活性を刺激するために DNA との相互作用を必要とする単一マルチ ドメインの Ca ヌクレアーゼ (Cas9) の使用を含むいくつかの有利な特徴によるゲノム編集用同種の DNA シーケンス18を対象とする 1 つのガイド RNA (sgRNA) の使用します。同種の sgRNA のターゲットに必要なシーケンス条件がよく分かって19と希望 sgRNA が簡単に生体外のトランスクリプションによって生成されます。シンプルさと堅牢性 CRISPR/Cas9 アプローチの大幅のゼブラフィッシュとさまざまな他の有機体で目標とされた遺伝子組み換えを容易になります。
中枢神経系の開発など脊椎動物の有機体の象徴的なプロセスを勉強する機会が増えて大幅に CRISPR ベースの試薬の開発の結果としてのゼブラフィッシュの標的ゲノム編集を引き受ける能力を強化システム。ゼブラフィッシュ ゲノムには人間22で病気と関連付けられる遺伝子の 84% と同様、人間のゲノムで見つけられた蛋白質のコーディングの遺伝子の 70% が含まれています。ゼブラフィッシュの開発が逆の遺伝学的研究での利用を高めるいくつかのキーの資質を展示: 大型クラッチにおける胚のレイアウト、マイクロインジェクションと大人のゼブラフィッシュによる遺伝的に操作をさせる母親から外部開発希望する行23の急速な伝播を可能にする、生後 3 か月で性的に成熟しました。
多数のプロトコルが利用可能な様々 な生成し、ゼブラフィッシュ24,25,26,27,28,29 CRISPR 派生オクターリピートの識別にアプローチを記述します。 ,,3031。ただし、これらの手順の多くは集中的な時間、高価な機器へのアクセスを必要とする、限られた専門知識を持つ研究所の挑戦することができます。本明細書に記載されている手順戦略を提供するシンプルで堅牢、かつ経済的な CRISPR/Cas9 - エンジニア ゼブラフィッシュ ノックアウト線に。32に説明したにされている他のアプローチと同様、このプロトコルは DNA オリゴヌクレオチド (oligos) を使用して sgRNAs を合成する非常に効率的なキットの使用を説明します。記述されていたプロトコルが特に 2 つの手順を含む CRISPR 変異線路の解析を大幅に簡素化: ゲノムの変更の有無とのシーケンス解析を簡単に決定する PCR に基づく HMA33のステップバイ ステップの使用ヘテロ接合体のゼブラフィッシュ迅速かつ容易には、経済的な方法で複数オクターリピートの性質を決定します。さらに、ステップバイ ステップの手順が堅牢な選択、信頼性の高い生産ガイド Rna の注射に含まれています。ここに示す手順は、ゼブラフィッシュの遺伝子のノックアウトの同定に貢献する専門知識の範囲で研究者を可能にする強力な比較的安価なプロトコルを例示します。
この手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュでCRISPR/Cas9技術を使用して標的ゲノム編集を行い、堅牢で安価な方法で遺伝子ノックアウトを操作することです。この方法は、遺伝子が高次真核生物の発生過程にどのように寄与するかなど、脊椎動物モデルシステムの文脈における遺伝子の生物学的役割に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。これらのシンプルで堅牢な手順により、学部生を含むあらゆるレベルの経験を持つ研究室の担当者が、ゼブラフィッシュの標的ゲノム改変を行うことができます。
この方法を初めて使用する個人は、CRISPR突然変異誘発の最適なゲノムターゲットを特定し、ゼブラフィッシュ胚マイクロインジェクションを実施し、修飾対立遺伝子を同定するための段階的な指示に従うことができるはずです。この方法は、必要な手法の1つ以上に慣れていない可能性のある学部生を対象としているため、この方法を視覚的に示しておくことが重要です。ガイドRNA産生のためのテンプレート特異的オリゴの設計に関するガイドラインは、テキストプロトコルに記載されています。
まず、Cas9タンパク質をバッファーに懸濁して、1ミリグラム/ミリリットルの溶液を生成します。この溶液は、後で使用するために摂氏マイナス80度の注射用アリコートに保管してください。次に、製造元の指示に従って、この記事の資料で提案されているようなin vitro転写キットでsgRNAを合成します。
RNAse遊離酢酸アンモニウム沈殿物を用いて、合成したsgRNAを精製します。合成したRNAに25マイクロリットルの5モル酢酸アンモニウムを加え、ボルテックスして溶液を混合します。次に、150マイクロリットルの200プルーフヌクレアーゼフリーエタノールをサンプルに加えます。
そして、反応をマイナス80°Cの冷凍庫に少なくとも20分間置きます。その後、サンプルを最高速度で遠心分離します。RNAペレットを乱さないように注意しながら、ピペットを使用して上清を取り除きます。
次に、70%エタノールを1ミリリットル加え、チューブを数回反転させてチューブから残留塩を洗い流します。再び最高速度で摂氏4度で7分間遠心分離します。P1000ピペットを使用して、ほとんどの溶液を取り出します。
次に、P200ピペットを使用して、ペレットを乱さずに残りの溶液をできるだけ多く除去します。RNAseの汚染を避けるように注意しながら、チューブ内に液滴が見えなくなるまで、清潔なスペースでペレットを乾燥させます。ペレットを30マイクロリットルのRNAseフリー水に再懸濁し、分光光度計を使用して製品を定量します。
マイナス80°Cで長期保存するための溶液を分注します。次に、300〜500ナノグラムのsgRNAを等量の2X RNAゲルローディング色素と混合します。次に、P1000ピペットを使用して、アガロースゲルウェルの破片をそれぞれ流動バッファーで数回取り除きます。
溶液をアガロースゲルウェルにロードし、ゲルを10ボルト/センチメートルで十分な時間泳動し、ゲル上のRNAバンドを分離します。時間は電気泳動装置によって異なる場合があります。一般に、染料のフロントはゲルの長さの2/3sまで実行する必要があります。
次に、核酸染色剤を使用してバンドを視覚化します。インタクト RNA は、ここに示すレーン 1 と 2 のように 1 つのバンドとして表示されます。分解されたRNAは、レーン3のような塗抹標本として実行されます。
まず、テキストプロトコルに記載されているように、注射を行う前夜にゼブラフィッシュの被験者を繁殖させる準備をします。次に、Cas9タンパク質とsgRNAを2対1の比率で組み合わせます。溶液を室温で5分間インキュベートし、Cas9とsgRNAがリボ核タンパク質複合体を形成します。
次に、十分なRNAseフリー水に0.5マイクロリットルの2.5%フェノール赤色溶液を加えて、最終容量を5マイクロリットルにします。注射針を準備するには、マイクロピペットプーラーを使用して1ミリメートルのガラスキャピラリーを引っ張ります。次に、得られたガラス針の先端をかみそりの刃で切断して、角度のついた開口部を取得します。
マイクロインジェクターに取り付けられたマイクロマニピュレーターに針を置きます。光学顕微鏡を使用して、針がペトリ皿に1ナノメートルの溶液を一貫して注入するまで、注入圧力を調整します。胚マイクロインジェクションを行う前に、色素のみの溶液を使用して針を準備し、コントロール胚を注入する練習をし、発生の24時間後の生存率を記録します。
注射されていないコントロールと比較して、90%以上の生存率を得ることができるはずです。次に、コントロール集団として10〜15個の胚を選択し、それらを別の標識シャーレに配置します。トランスファーピペットを使用して、残りの胚を室温の注入プレートに慎重に並べます。
解剖顕微鏡下で、各胚の卵黄嚢に1ナノリットルの溶液を注入します。次に、注入した胚を標識されたペトリ皿に戻し、メチレンブルーの1X E3培地で覆います。注入した胚を摂氏28度のインキュベーターに24時間置きます。
次に、注入された胚を検査して、死亡した個体または異常に発達している個体を切除します。まず、注入された胚を含むプレートから5つの72時間齢の胚を2セット、および注入されていない対照群から5つの72時間経過の胚を1セットをマイクロ遠心チューブに収集します。各胚セットから培地を静かにピペットで取り出し、麻酔をかけます。
2分後に麻酔薬を取り外し、45マイクロリットルの50ミリモル水酸化ナトリウムを追加します。次に、サンプルを95度で10分間インキュベートします。次に、インキュベーターからサンプルを取り出し、室温まで冷まします。
5マイクロリットルの1モルpHトリス塩酸塩を加え、サンプルを激しくボルテックスします。次に、溶液を室温で最高速度で3分間遠心分離します。ゲノムDNAを含む上清を新しい標識チューブに移し、gDNAをマイナス20°Cで保存します。
本文に記載されているように、sgRNA標的領域の周囲を増幅するように設計されたプライマーを使用して、ヘテロデュプレックス解析用のPCRフラグメントを増幅します。PCRクリーンアップキットを使用して、PCR反応の産物を精製します。サンプルを30マイクロリットルの水で希釈し、分光光度計を使用してDNAを定量します。
PCRアンプリコンの入ったチューブを沸騰水浴のフローティングラックに入れます。次に、30%ポリアクリルアミドを使用して15%ポリアクリルアミドTBEゲルを調製します。ゲルが固まったら、TBEランニングバッファー付きの電気泳動装置に入れます。
次に、500ナノグラムの再アニーリングされたPCR産物をロードし、sgRNAサンプルの各セットの隣にコントロールをロードします。ゲルを150ボルトで2時間半、または染料の前面がゲルの底に来るまで泳がせます。ゼブラフィッシュの胚を注入して成体になるまで成長し、HMAにヘテロデュプレックスバンドを示します。
HMAを解釈するには、野生型の非注入コントロールのPCRからのホモデュプレックスバンドの強度を、対応する注入サンプルと比較します。十分な切断が行われた場合、注入された魚からのバンドの強度は、野生型コントロールよりも約50%低くする必要があります。潜在的な創設者の親魚にインデルの存在を確認するには、0.004%トリカインで魚を麻酔し、きれいなカミソリの刃を使用して尾びれの1/2〜3/4を取り除きます。
次に、尾を45マイクロリットルの50ミリモル水酸化ナトリウムに入れます。魚を回収タンクに戻し、前述のようにgDNA抽出を行います。次に、テールクリップgDNAでHMAを行い、CRISPR注入によって個体が正常に修飾されたかどうかを判断します。
次に、尾部DNAにヘテロデュプレックスバンドを示す成体を野生型の魚に繁殖させます。ファウンダーフィッシュを選択して、プールのHMA分析に基づいてF1フィッシュを生成します。最後に、目的の魚のgDNAを配列決定して、インデルの性質を特徴付けます。
CRISPR試薬の作製とマイクロインジェクションが成功した後、ゼブラフィッシュの胚の明白な表現型とインデル形成についてHMAを用いて分析しました。Cas9はチロシナーゼでのインデル形成を誘発し、色素沈着の喪失をもたらし、受精後48時間で容易にスコアリングされます。明白な発生表現型をもたらさないCRISPR修飾対立遺伝子の同定は、HMAを用いて行われる。
目的遺伝子の標的化が成功すると、ヘテロ二本鎖バンドが形成され、レーン3や4などのホモデュプレックスバンドの強度が減少します。脊椎動物と協力することには倫理的な責任が伴うことを忘れないでください。このプロトコルでは、ノックアウトを得るために必要なゼブラフィッシュの数を最小限に抑える戦略を説明しています。この目標は、この手順を実行する際に考慮すべき目標です。
この手法を習得すれば、CRISPR修飾対立遺伝子を保有するゼブラフィッシュを迅速に生成し、同定することができます。ゼブラフィッシュは、生殖細胞系に高効率で伝達されます。重要なことに、この手法は、学部生や経験の少ない他の人に適した低コストのアプローチになるように最適化されています。このビデオを見れば、ゼブラフィッシュを使用してCRISPRベースの遺伝子ノックアウトアプローチを簡単に設計し、実装する方法を十分に理解できるはずです。