De instandhouding van de moleculaire machines in eukaryoten ten grondslag ligt aan de kracht van het gebruik van modelorganismen voor onderzoek. Veel van deze modelsystemen vergemakkelijken het gebruik van omgekeerde-genetische benaderingen zoals gerichte gene uitsparingen te karakteriseren van de bijdrage van een gen-product met een biologische of ziekte proces van belang. Gene verstoring technieken in organismen zoals zebrafish hebben historisch vertrouwd op gerichte invoering van frameshift mutaties die uit de onnauwkeurige reparatie van DSBs1,2 voortvloeien. Wanneer een DSB is ingevoerd in het genoom, de DNA-laesie is gerepareerd door een van de twee trajecten die universeel aanwezig in bijna alle soorten cellen en organismen zijn: niet-homologe einde deelname aan (NHEJ) en homologie geleide reparatie (HDR)3,4 . De onnauwkeurige aard van de NHEJ machine produceert vaak microdeleties van verschillende lengtes5,6,7,8,9. Invoering van frameshift mutaties in de codering sequentie van een gen kan produceren een voortijdige stop codon, waardoor vaak de gene achterblijven.
Vroege genoom engineering strategieën in zebrafish ter bevordering van microdeleties opgenomen meganucleases, zink-vinger nucleasen en transcriptie activator-achtige effector nucleasen, die allemaal DNA-eiwit interactie gebruikt te richten op een nuclease aan een specifieke genomic doel waar het een DSB10,11,12,13,14,15ingevoerd. Deze technologieën zijn echter vaak moeilijk toe te passen als gevolg van de moeizame en ingewikkelde techniek nodig om te genereren een nuclease die zich richt op de opeenvolging van DNA van belang. In tegenstelling tot eerdere strategieën afhankelijk gene CRISPR gebaseerde bewerken niet is van eiwit-DNA interacties voor targeting. In plaats daarvan is de CRISPR-geassocieerde (Cas) endonuclease gericht via een RNA-gids die gebruikmaakt van de nucleotide base paren interacties te richten een genomic site van belang16,17,18,19 2120, ,. Als gevolg van de eenvoud van het ontwerpen van een RNA is gids met de gewenste base interacties voor targeting het in paren rangschikken relatief eenvoudig om de Cas endonuclease naar de gewenste plaats. Het type II CRISPR systeem is in het bijzonder sterk ontwikkeld voor genoom uitgeven toepassingen als gevolg van verschillende voordelige eigenschappen met inbegrip van gebruik van een enkele met meerdere domeinen Cas nuclease (Cas9) die interactie met DNA te stimuleren endonuclease activiteit vereist en gebruik van een enkele gids RNA (sgRNA) om te richten het op de DNA sequentie van cognaat18. De reeks eisen die noodzakelijk zijn voor het targeten van de cognaat sgRNA zijn goed begrepen19, en de gewenste sgRNA gemakkelijk door in vitro transcriptie wordt gegenereerd. De eenvoud en robuustheid van de CRISPR/Cas9-aanpak vergemakkelijkt sterk gerichte genetische modificatie in de zebravis en een grote verscheidenheid van andere organismen.
De verbeterde mogelijkheid ertoe gerichte genoom bewerken in de zebravis als gevolg van de ontwikkeling van de CRISPR gebaseerde reagentia aanzienlijk heeft verhoogd de kans om processen karakteristieke van gewervelde organismen zoals ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel te bestuderen systeem. De zebravis genoom van Sinorhizobium orthologs van 70% van de eiwit-codeert genen gevonden in het menselijk genoom alsmede 84% van de genen die ziekten bij de mens22is gekoppeld. Zebravis ontwikkeling vertoont enkele key kwaliteiten die het gebruik ervan in omgekeerde genetische studies verbeteren: de embryo's worden gelegd in grote klauwen, extern te ontwikkelen van de moeder, waardoor ze zich lenen voor genetische manipulatie door microinjection, en volwassen zebravis seksueel volwassen door 3 maanden oud, waardoor snelle teeltmateriaal voor gewenste lijnen23.
Er zijn talrijke protocollen beschikbaar die beschrijven een aantal verschillende benaderingen te genereren en te identificeren CRISPR afkomstige microdeleties in zebrafish24,25,26,27,28,29 ,30,31. Veel van deze procedures zijn echter tijd intensief, toegang tot dure apparatuur nodig, en kunnen lastig zijn voor labs met beperkte expertise. De hierin beschreven stappen bieden een eenvoudige, robuuste en economische CRISPR/Cas9-strategie voor de ingenieur zebrafish knock-out lijnen. Dit protocol beschrijft het gebruik van een zeer efficiënte kit voor het synthetiseren van sgRNAs met behulp van DNA oligonucleotides (oligos), vergelijkbaar met andere benaderingen die al eerder beschreven32. Het beschreven protocol omvat twee stappen in het bijzonder die sterk analyse van CRISPR-gemuteerd lijnen vereenvoudigen: stapsgewijze gebruik van de PCR-gebaseerde HMA33 gemakkelijk bepalen de aanwezigheid van genoom wijzigingen en sequencing analyse van heterozygoot zebrafish snel en gemakkelijk bepalen de aard van meerdere microdeleties op een economische manier. Daarnaast zijn stapsgewijze instructies opgenomen voor selectie van de robuuste, betrouwbare productie en injectie van gids RNAs. De stappen hier illustreren een robuust, relatief goedkope protocol waarmee laboratoriumpersoneel met een scala aan expertise bij te dragen aan de identificatie van het gen uitsparingen in zebrafish.
Het algemene doel van deze procedure is om gerichte genoombewerking uit te voeren met behulp van CRISPR/Cas9-technologie bij zebravissen om gen-knockouts op een robuuste, goedkope manier te ontwikkelen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de biologische rol van een gen in de context van een modelsysteem van gewervelde dieren, zoals hoe een gen bijdraagt aan ontwikkelingsprocessen in hogere eukaryoten. Met deze eenvoudige, robuuste procedures kunnen laboratoriumpersoneel van alle ervaringsniveaus, inclusief studenten, gerichte genomische modificaties bij zebravissen uitvoeren.
Personen die nieuw zijn in deze methode, zouden de stapsgewijze instructies moeten kunnen volgen om optimale genomische doelen voor CRISPR-mutagenese te identificeren, zebravis-embryo-micro-injectie uit te voeren en gemodificeerde allelen te identificeren. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang, aangezien deze methode is bedoeld voor studenten die mogelijk onbekend zijn met een of meer van de noodzakelijke technieken. Richtlijnen voor het ontwerp van template-specifieke oligo's voor de productie van geleide RNA worden gegeven in het tekstprotocol.
Om te beginnen, schorst u het Cas9-eiwit in buffer om een oplossing van één milligram per milliliter te genereren. Bewaar deze oplossing in injectieklare aliquots bij minus 80 graden Celsius voor later gebruik. Synthetiseer vervolgens de sgRNA met een in vitro transcriptiekit zoals degene die wordt gesuggereerd in de materialen van dit artikel volgens de instructies van de fabrikant.
Zuiver de gesynthetiseerde sgRNA met behulp van een RNAse-vrije ammoniumacetaatprecipitatie. Voeg 25 microliters vijf molaire ammoniumacetaat toe aan het gesynthetiseerde RNA en meng de oplossing door te vortexen. Voeg vervolgens 150 microliters 200 bewijs nuclease-vrij ethanol toe aan het monster.
En plaats de reactie in een min 80 graden Celsius vriezer gedurende minimaal 20 minuten. Centrifugeer vervolgens de monsters op maximale snelheid. Gebruik een pipet om het supernatant te verwijderen en zorg ervoor dat het RNA-pellet niet wordt verstoord.
Voeg vervolgens één milliliter 70%ethanol toe en draai de buis meerdere keren om resterend zout uit de buis te wassen. Centrifugeer opnieuw bij maximale snelheid bij vier graden Celsius gedurende zeven minuten. Gebruik een P1000-pipet om het grootste deel van de oplossing te verwijderen.
Gebruik vervolgens een P200-pipet om zoveel mogelijk van de resterende oplossing te verwijderen zonder het pellet te verstoren. Zorg ervoor dat u RNAse-besmetting vermijdt, droog het pellet in een schone ruimte tot er geen vloeibare druppels meer zichtbaar zijn in de buis. Resuspendeer het pellet in 30 microliters RNAse-vrij water en gebruik een spectrofotometer om het product te kwantificeren.
Deel de oplossing in aliquoten in voor langdurige opslag bij min 80 graden Celsius. Meng vervolgens 300 tot 500 nanogram sgRNA met een gelijk volume van 2X RNA-gel-laaddye. Gebruik vervolgens een P1000-pipet om elk van de agarose-gelwelletjes meerdere keren te ontdoen van puin met behulp van running buffer.
Laad de oplossingen in de agarose-gelwelletjes en laat de gel draaien bij 10 volt per centimeter gedurende voldoende tijd om de RNA-banden op de gel te scheiden. De tijd kan variëren per elektroforese-apparaat. Over het algemeen zou de kleurstoffront tot 2/3 van de lengte van de gel moeten worden uitgevoerd.
Gebruik vervolgens een nucleïnezuurkleuring om de banden te visualiseren. Intact RNA verschijnt als een enkele band zoals in baan een en twee hier getoond. Gedegradeerd RNA loopt als een vlek zoals in baan drie.
Bereidt eerst de zebravis-subjecten voor het fokken de nacht voorafgaand aan het uitvoeren van injecties voor, zoals beschreven in het tekstprotocol. Combineer vervolgens Cas9-eiwit en sgRNA in een twee-naar-één-verhouding. Incubeer de oplossing bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten terwijl Cas9 en sgRNA een ribonucleoproteïnecomplex vormen.
Voeg vervolgens 0,5 microliter 2,5% fenolrode oplossingen toe in voldoende RNAse-vrij water om een eindvolume van vijf microliters te bereiken. Gebruik een micropipettrekker om een glascapillair van één millimeter te trekken om de injectienaald voor te bereiden. Snijd vervolgens de punt van de resulterende glazen naald af met een scheermes om een hoekige opening te verkrijgen.
Plaats de naald in een micromanipulator die is bevestigd aan een micro-injector. Stel met behulp van een lichtmicroscoop de injectiedruk in totdat de naald consistent één nanometer oplossing in de petrischaal injecteert. Oefen het voorbereiden van naalden en het injecteren van controle-embryo's met behulp van alleen een kleurstofoplossing en neem de overleving na 24 uur ontwikkeling op voordat u embryo-micro-injectie uitvoert.
U zou meer dan 90% overleving moeten kunnen bereiken vergeleken met een niet-geïnjecteerde controle. Selecteer vervolgens 10 tot 15 embryo's als controlepopulatie en plaats ze in een afzonderlijk gelabelde petrischaal. Gebruik een transferpipet om de resterende embryo's voorzichtig op een injectieplaat op kamertemperatuur uit te lijnen.
Injecteer onder een dissectiemicroscoop één nanoliter van de oplossing in de dooierzak van elk embryo. Breng vervolgens de geïnjecteerde embryo's terug naar een gelabelde petrischaal en bedek ze met 1X E3-media met methyleenblauw. Plaats de geïnjecteerde embryo's in een incubator bij 28 graden Celsius gedurende 24 uur.
Inspecteer vervolgens de geïnjecteerde embryo's om dode of abnormaal ontwikkelende individuen te verwijderen. Verzamel eerst twee sets van vijf 72 uur oude embryo's van de platen met geïnjecteerde embryo's en één set van vijf 72 uur oude embryo's van de niet-geïnjecteerde controlegroep in de microcentrifugebuisjes. Pipetteer voorzichtig het media van elke embryoset en anesthesiseer ze.
Verwijder het anestheticum na twee minuten en voeg 45 microliter 50 millimolair natriumhydroxide toe. Bewaar vervolgens de monsters gedurende 10 minuten bij 95 graden. Vervolgens verwij