Zachowanie maszynerii molekularnej u eukariontów leży u podstaw możliwości wykorzystania organizmów modelowych do badań. Wiele z tych systemów modelowych ułatwia stosowanie podejść opartych na odwróconej genetyce, takich jak celowane nokauty genów, w celu scharakteryzowania wkładu produktu genetycznego w proces biologiczny lub chorobowy będący przedmiotem zainteresowania. Techniki zakłócania genów u organizmów takich jak danio pręgowany historycznie opierały się na ukierunkowanym wprowadzaniu mutacji przesunięcia ramki odczytu, które wynikają z nieprecyzyjnej naprawy DSBs1,2. Kiedy DSB jest wprowadzany do genomu, uszkodzenie DNA jest naprawiane przez jeden z dwóch szlaków, które są powszechnie obecne w prawie wszystkich typach komórek i organizmów: niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) i naprawa ukierunkowana na homologię (HDR)3,4. Nieprecyzyjny charakter maszyn NHEJ często wytwarza indele o różnych długościach5,6,7,8,9. Wprowadzenie mutacji przesunięcia ramki odczytu w sekwencji kodującej gen może wytworzyć przedwczesny kodon stop, który często powoduje, że gen staje się niefunkcjonalny.
Wczesne strategie inżynierii genomu u danio pręgowanego mające na celu promowanie indeli obejmowały meganukleazy, nukleazy palców cynkowych i nukleazy efektorowe podobne do aktywatorów transkrypcji, z których wszystkie wykorzystywały interakcje DNA-białko do kierowania nukleazy do określonego celu genomowego, gdzie wprowadzały DSB10,11,12,13,14,15. Jednak technologie te są często trudne do zastosowania ze względu na pracochłonną i złożoną inżynierię potrzebną do wygenerowania nukleazy, która celuje w sekwencję DNA, która jest przedmiotem zainteresowania. W przeciwieństwie do poprzednich strategii, edycja genów oparta na CRISPR nie opiera się na interakcjach białko-DNA w celu ukierunkowania. Zamiast tego endonukleaza związana z CRISPR (Cas) jest kierowana przez przewodnik RNA, który wykorzystuje interakcje parowania zasad nukleotydowych, aby celować w interesujące miejsce genomu16,17,18,19,20,21. Ze względu na prostotę projektowania przewodnika RNA z pożądanymi interakcjami parowania zasad do celowania, stosunkowo łatwo jest skierować endonukleazę Cas do pożądanego locus. W szczególności system CRISPR typu II został szeroko opracowany do zastosowań związanych z edycją genomu ze względu na kilka korzystnych cech, w tym zastosowanie pojedynczej wielodomenowej nukleazy Cas (Cas9), która wymaga interakcji z DNA w celu stymulacji aktywności endonukleazy oraz użycie pojedynczego przewodnika RNA (sgRNA) w celu ukierunkowania go na pokrewną sekwencję DNA18. Wymagania dotyczące sekwencji niezbędne do celowania w pokrewne sgRNA są dobrze poznane19, a pożądany sgRNA można łatwo wygenerować przez transkrypcję in vitro. Prostota i solidność podejścia opartego na CRISPR/Cas9 znacznie ułatwia ukierunkowaną modyfikację genetyczną u danio pręgowanego i wielu innych organizmów.
Zwiększona zdolność do celowej edycji genomu u ryb pręgowanych w wyniku opracowania odczynników opartych na CRISPR znacznie zwiększyła możliwość badania procesów charakterystycznych dla organizmów kręgowców, takich jak rozwój ośrodkowego układu nerwowego. Genom danio pręgowanego zawiera ortologi 70% genów kodujących białka znajdujących się w ludzkim genomie, a także 84% genów związanych z chorobami u ludzi22. Rozwój danio pręgowanego wykazuje kilka kluczowych cech, które zwiększają jego zastosowanie w odwrotnych badaniach genetycznych: zarodki są składane w dużych lęgach, rozwijają się zewnętrznie od matki, co czyni je podatnymi na manipulację genetyczną przez mikroiniekcję, a dorosłe danio pręgowane osiągają dojrzałość płciową w wieku 3 miesięcy, co pozwala na szybkie rozmnażanie pożądanych linii23.
Dostępnych jest wiele protokołów, które opisują różne podejścia do generowania i identyfikacji indeli pochodzących z CRISPR u danio pręgowanego24,25,26,27,28,29,30,31. Jednak wiele z tych procedur jest czasochłonnych, wymaga dostępu do drogiego sprzętu i może stanowić wyzwanie dla laboratoriów o ograniczonej wiedzy specjalistycznej. Kroki opisane w tym dokumencie zapewniają prostą, solidną i ekonomiczną strategię CRISPR/Cas9 do projektowania linii do wybijania danio pręgowanego. Protokół ten opisuje użycie wysoce wydajnego zestawu do syntezy sgRNA przy użyciu oligonukleotydów DNA (oligonukleotydów), podobnie jak w przypadku innych podejść, które zostały wcześniej opisane32. Opisany protokół obejmuje w szczególności dwa kroki, które znacznie upraszczają analizę linii zmutowanych przez CRISPR: krok po kroku użycie opartego na PCR HMA33 w celu łatwego określenia obecności modyfikacji genomu oraz analizę sekwencjonowania heterozygotycznego danio pręgowanego w celu szybkiego i łatwego określenia charakteru wielu indeli w ekonomiczny sposób. Ponadto dołączone są instrukcje krok po kroku dotyczące solidnej selekcji, niezawodnej produkcji i wstrzykiwania przewodników RNA. Przedstawione tutaj kroki są przykładem solidnego, stosunkowo niedrogiego protokołu, który umożliwia personelowi laboratoryjnemu posiadającemu szeroką wiedzę specjalistyczną przyczynienie się do identyfikacji nokautów genów u danio pręgowanego.
Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie ukierunkowanej edycji genomu przy użyciu technologii CRISPR/Cas9 u danio pręgowanego w celu inżynierii nokautów genów w solidny i niedrogi sposób. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące biologicznej roli genu w kontekście systemu modelowego kręgowców, takie jak to, w jaki sposób gen przyczynia się do procesów rozwojowych u eukariontów wyższego rzędu. Dzięki tym prostym, solidnym procedurom personel laboratoryjny na wszystkich poziomach doświadczenia, w tym studenci, może przeprowadzać ukierunkowane modyfikacje genomu u danio pręgowanego.
Osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, powinny być w stanie postępować zgodnie z instrukcjami krok po kroku, aby zidentyfikować optymalne cele genomowe dla mutagenezy CRISPR, wykonać mikroiniekcję zarodka danio pręgowanego i zidentyfikować zmodyfikowane allele. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ metoda ta jest przeznaczona dla studentów, którzy mogą nie być zaznajomieni z jedną lub kilkoma niezbędnymi technikami. Wytyczne dotyczące projektowania specyficznych dla matrycy oligonukleotydów do produkcji przewodnikowego RNA znajdują się w protokole tekstowym.
Na początek zawiesić białko Cas9 w buforze, aby wytworzyć jeden miligram na mililitr roztworu. Roztwór ten należy przechowywać w podwielokrotnościach gotowych do wstrzykiwań, w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do późniejszego użycia. Następnie zsyntetyzuj sgRNA za pomocą zestawu do transkrypcji in vitro, takiego jak ten sugerowany w materiałach tego artykułu, zgodnie z instrukcjami producenta.
Oczyść zsyntetyzowane sgRNA za pomocą wytrącania octanu amonu wolnego od RNAzy. Dodaj 25 mikrolitrów pięciomolowego octanu amonu do zsyntetyzowanego RNA i wymieszaj roztwór przez wirowanie. Następnie dodaj do próbki 150 mikrolitrów 200-procentowego etanolu wolnego od nukleaz.
I umieść reakcję w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na co najmniej 20 minut. Następnie odwirować próbki z maksymalną prędkością. Użyć pipety, aby usunąć supernatant, uważając, aby nie naruszyć osadu RNA.
Następnie dodaj jeden mililitr 70% etanolu i kilkakrotnie odwróć rurkę, aby zmyć resztki soli z tubki. Ponownie odwirować z maksymalną prędkością w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez siedem minut. Użyj pipety P1000, aby usunąć większość roztworu.
Następnie użyj pipety P200, aby usunąć jak najwięcej pozostałego roztworu bez naruszania granulki. Uważając, aby uniknąć zanieczyszczenia RNAzą, wysuszyć osad w czystym miejscu, aż w probówce nie będą widoczne krople cieczy. Zawiesić osad w 30 mikrolitrach wody wolnej od RNA i użyć spektrofotometru do ilościowego określenia produktu.
Podaj roztwór do długotrwałego przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Następnie wymieszaj od 300 do 500 nanogramów sgRNA z równą objętością barwnika ładującego żel 2X RNA. Następnie, za pomocą pipety P1000, kilkakrotnie oczyść każdą z studzienek żelu agarozowego z zanieczyszczeń za pomocą buforu bieżącego.
Załaduj roztwory do studzienek żelu agarozowego i uruchom żel pod napięciem 10 woltów na centymetr przez wystarczająco dużo czasu, aby oddzielić prążki RNA na żelu. Czas może się różnić w zależności od aparatu do elektroforezy. Ogólnie rzecz biorąc, przód barwnika powinien być prowadzony do 2/3 s długości żelu.
Następnie użyj barwnika kwasu nukleinowego, aby uwidocznić pasma. Nienaruszone RNA pojawia się jako pojedynczy prążek, taki jak na pierwszym i drugim pasie pokazanym tutaj. Zdegradowany RNA przebiega jako rozmaz, taki jak na trzecim pasie.
Po pierwsze, przygotuj osoby badane danio pręgowanego do rozmnażania w noc poprzedzającą wykonanie zastrzyków, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie połącz białko Cas9 i sgRNA w stosunku dwa do jednego. Inkubuj roztwór w temperaturze pokojowej przez pięć minut, podczas gdy Cas9 i sgRNA tworzą kompleks rybonukleoproteinowy.
Następnie dodaj 0,5 mikrolitra 2,5% roztworów czerwieni fenolowej do wystarczającej ilości wody wolnej od RNA, aby uzyskać końcową objętość pięciu mikrolitrów. Aby przygotować igłę do wstrzykiwań, należy użyć ściągacza do mikropipet, aby naciągnąć szklaną kapilarnę o średnicy jednego milimetra. Następnie odetnij końcówkę powstałej szklanej igły żyletką, aby uzyskać kątowy otwór.
Umieść igłę w mikromanipulatorze podłączonym do mikrowtryskiwacza. Używając mikroskopu świetlnego, wyreguluj ciśnienie wstrzykiwania, aż igła będzie konsekwentnie wstrzykiwać jeden nanometr roztworu na szalkę Petriego. Przed wykonaniem mikroiniekcji zarodka należy przećwiczyć przygotowywanie igieł i wstrzykiwanie zarodków kontrolnych przy użyciu roztworu zawierającego wyłącznie barwnik i odnotować przeżycie po 24 godzinach od rozwoju.
Powinieneś być w stanie uzyskać więcej niż 90% przeżycia w porównaniu z grupą kontrolną bez wstrzyknięcia. Następnie wybierz od 10 do 15 zarodków jako populację kontrolną i umieść je na osobnej oznakowanej szalce Petriego. Za pomocą pipety transferowej ostrożnie ułożyć pozostałe zarodki na płytce do wstrzykiwań o temperaturze pokojowej.
Pod mikroskopem preparacyjnym wstrzyknąć jeden nanolitr roztworu do woreczka żółtkowego każdego zarodka. Następnie umieść wstrzyknięte zarodki na oznakowanej szalce Petriego i przykryj je pożywką 1X E3 z błękitem metylenowym. Umieść wstrzyknięte zarodki w inkubatorze w temperaturze 28 stopni Celsjusza na 24 godziny.
Następnie należy sprawdzić wstrzyknięte zarodki, aby usunąć martwe lub nieprawidłowo rozwijające się osoby. Najpierw należy pobrać dwa zestawy pięciu 72-godzinnych zarodków z płytek zawierających wstrzyknięte zarodki i jeden zestaw pięciu 72-godzinnych zarodków z niewstrzykniętej grupy kontrolnej do probówek mikrowirówkowych. Delikatnie odpipetować pożywkę z każdego zestawu zarodków i znieczulić je.
Usuń środek znieczulający po dwóch minutach i dodaj 45 mikrolitrów 50-milimolowego wodorotlenku sodu. Następnie inkubować próbki w temperaturze 95 stopni przez 10 minut. Następnie wyjmij próbki z inkubatora i pozwól im ostygnąć do temperatury pokojowej.
Dodać pięć mikrolitrów jednego molowego chlorowodorku tris o pH i energicznie wirować próbki. Następnie odwiruj roztwór z maksymalną prędkością w temperaturze pokojowej przez trzy minuty. Przenieś supernatant, który zawiera genomowe DNA, do nowej znakowanej probówki i przechowuj gDNA w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.
Użyj starterów przeznaczonych do amplifikacji wokół regionu docelowego sgRNA, jak opisano w tekście, aby amplifikować fragment PCR do analizy heterodupleksowej. Użyj zestawu do czyszczenia PCR, aby oczyścić produkty reakcji PCR. Rozcieńczyć próbki w 30 mikrolitrach wody i użyć spektrofotometru do ilościowego określenia DNA.
Umieścić probówki zawierające amplikony PCR w pływającym stojaku we wrzącej łaźni wodnej. Następnie przygotuj 15% poliakryloamidowy żel do KZMiK przy użyciu 30% poliakrylamidu. Po stężeniu żelu należy umieścić go w aparacie do elektroforezy z buforem do pracy TBE.
Następnie załaduj 500 nanogramów odnowionych produktów PCR i załaduj kontrolę obok każdego zestawu próbek sgRNA. Uruchom żel pod napięciem 150 woltów przez dwie i pół godziny lub do momentu, gdy przód barwnika znajdzie się na dnie żelu. Dorastaj z wstrzykniętymi zarodkami danio pręgowanego do dorosłości, które wykazują heterodupleksowe prążki w HMA.
Aby zinterpretować HMA, należy porównać intensywność pasma homodupleksu z PCR niewstrzykniętej kontroli typu dzikiego z odpowiednimi wstrzykniętymi próbkami. Jeśli nastąpiło wystarczające cięcie, intensywność pasma od wstrzykniętych ryb powinna być o około 50% mniejsza niż w przypadku kontroli typu dzikiego. Aby potwierdzić obecność indeli u potencjalnych ryb rodzicielskich, należy znieczulić rybę w 0,004% tricainie i użyć czystej żyletki, aby usunąć od 1/2 do 3/4 płetwy ogonowej.
Następnie umieść ogon w 45 mikrolitrach 50-milimolowego wodorotlenku sodu. Zwróć rybę do zbiornika regeneracyjnego i przeprowadź ekstrakcję gDNA zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie wykonaj HMA na gDNA klipsa ogonowego, aby określić, czy dana osoba została pomyślnie zmodyfikowana przez wstrzyknięcie CRISPR.
Następnie rozmnażaj dorosłe osobniki, które wykazują heterodupleksowe prążki w DNA ogona, z rybami typu dzikiego. Wybierz rybę założyciela, aby wygenerować ryby F1 na podstawie analizy HMA puli. Na koniec zsekwencjonuj gDNA interesującej ryby, aby scharakteryzować naturę indela.
Po udanej produkcji i mikrowstrzyknięciu odczynników CRISPR, zarodki danio pręgowanego przeanalizowano pod kątem jawnych fenotypów i tworzenia indeli za pomocą HMA. Tworzenie indelu indelowego przez Cas9 w tyrozynazie powoduje utratę pigmentacji i jest łatwe do oceny w ciągu 48 godzin po zapłodnieniu. Identyfikacja alleli zmodyfikowanych przez CRISPR, które nie powodują jawnych fenotypów rozwojowych, odbywa się za pomocą HMA.
Skuteczne ukierunkowanie na gen będący przedmiotem zainteresowania powoduje powstawanie prążków heterodupleksowych i zmniejszenie intensywności pasma homodupleksu, np. na pasach trzecim i czwartym. Nie zapominaj, że praca z organizmem kręgowców wiąże się z odpowiedzialnością etyczną. Protokół ten opisuje strategie, które minimalizują liczbę danio pręgowanego potrzebnego do uzyskania nokautu, cel, który należy wziąć pod uwagę podczas wykonywania tej procedury.
Po opanowaniu technika ta może być wykorzystana do szybkiego generowania i identyfikacji danio pręgowanego przenoszących allele zmodyfikowane CRISPR, które będą przekazywane w linii zarodkowej z wysoką wydajnością. Co ważne, technika ta została zoptymalizowana tak, aby była tanim podejściem dostępnym dla studentów i innych osób z niewielkim wcześniejszym doświadczeniem. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak łatwo zaprojektować i wdrożyć podejście do nokautowania genów oparte na CRISPR przy użyciu danio pręgowanego.