A conservação de máquinas moleculares em eucariontes subjaz o poder do uso de organismos modelo para pesquisa. Muitos destes sistemas modelo facilitam a utilização de abordagens reverso-genética como nocautes alvejado do gene para caracterizar a contribuição de um produto do gene de um processo biológico ou doença de interesse. Técnicas de perturbação genética em organismos como o zebrafish historicamente têm confiado na introdução alvo de mutações frameshift resultantes da reparação imprecisa de DSBs1,2. Quando um ORL é introduzido no genoma, a lesão de DNA é reparada através de um dos dois caminhos que estão universalmente presentes em quase todos os tipos de células e organismos: não-homóloga final juntando (NHEJ) e reparação de homologia-dirigido (HDR)3,4 . A natureza imprecisa da maquinaria NHEJ frequentemente produz puntuais de vários comprimentos5,6,7,8,9. Introdução de mutações frameshift, na sequência de codificação de um gene pode produzir um codão stop prematuro, que muitas vezes torna o gene não-funcionais.
Primeiras estratégias de engenharia do genoma no zebrafish para promover puntuais incluíam meganucleases, nucleases de zinco-dedo e nucleases de ativador, como efetoras transcrição, os quais utilizaram interações DNA-proteína para direcionar uma nuclease para um determinado genoma destino onde introduziu um ORL10,11,12,13,14,15. No entanto, essas tecnologias são muitas vezes difíceis de aplicar devido a trabalhosa e complexa engenharia necessária para gerar uma nuclease que tem como alvo a sequência de DNA de interesse. Ao contrário de estratégias anteriores, baseadas em CRISPR gene edição não depende de interações proteína-ADN para o direcionamento. Em vez disso, a endonuclease CRISPR-associado (Cas) é direcionado por meio de um guia de RNA que usa base de interações de emparelhamento de nucleotídeos para direcionar um site genômico de interesse16,17,18,19 ,20,21. Devido à simplicidade de projetar um RNA guia com a base desejada emparelhamento interações para o direcionamento é relativamente fácil de direcionar a endonuclease de Cas para o local desejado. O tipo II CRISPR sistema em particular foi amplamente desenvolvido para aplicações de edição de genoma devido a várias características vantajosas, incluindo o uso de um único vários domínios Cas nuclease (Cas9) que requer a interação com o DNA de estimular a atividade endonuclease e uso de um único guia do RNA (sgRNA) para destiná-las para o cognato de sequência de DNA18. Os requisitos de sequência necessários para o direcionamento do cognato sgRNA são bem compreendido,19, e o sgRNA desejado é facilmente gerado pela transcrição em vitro . A simplicidade e robustez da abordagem CRISPR/Cas9 facilita grandemente a modificação genética direcionada no zebrafish e uma grande variedade de outros organismos.
A capacidade avançada de empreender genoma alvo edição no zebrafish como resultado de desenvolvimento baseado em CRISPR reagentes tem significativamente aumentado a oportunidade de estudar processos emblemáticos de organismos vertebrados tais como desenvolvimento do nervoso central sistema. O genoma de zebrafish contém orthologs de 70% dos genes codificantes de proteínas encontrados no genoma humano bem como 84% dos genes associados a doenças em seres humanos22. Desenvolvimento de zebrafish exibe várias qualidades-chave que melhoram a sua utilização em estudos de genéticas reversos: os embriões são colocados em grandes garras, desenvolvem-se externamente da mãe tornando-os passíveis de genética manipulação por microinjeção e adultos do zebrafish sexualmente maduros por 3 meses de idade, permitindo a rápida propagação de linhas desejado23.
Existem inúmeros protocolos que descrevem uma variedade de abordagens para gerar e identificar puntuais CRISPR-derivado no zebrafish24,25,26,,27,28,29 ,30,31. No entanto, muitos desses procedimentos são tempo intensivo, requerem acesso a equipamentos caros e podem ser um desafio para laboratórios com experiência limitada. As etapas descritas neste documento fornecem uma simples, robusta e econômica CRISPR/Cas9-estratégia para engenheiro zebrafish nocaute linhas. Este protocolo descreve o uso de um kit altamente eficiente para sintetizar sgRNAs usando oligonucleotídeos de DNA (oligos), semelhante a outras abordagens que foram anteriormente descritas32. O protocolo descrito inclui duas etapas em particular que simplificar a análise das linhas CRISPR-mutação: passo a passo uso do HMA baseados em PCR33 para determinar facilmente a presença de modificações do genoma e análise de sequenciamento de zebrafish heterozigoto para rapidamente e facilmente determinar a natureza do múltiplo puntuais de forma econômica. Além disso, instruções passo a passo são incluídas para seleção robusta, confiável produção e injeção de guia RNAs. As etapas fornecidas aqui exemplificam um protocolo robusto, relativamente barato que permite que o pessoal de laboratório com uma gama de conhecimentos contribuir para a identificação dos nocautes gene no zebrafish.
O objetivo geral deste procedimento é realizar a edição do genoma direcionada usando a tecnologia CRISPR / Cas9 em peixe-zebra para projetar nocautes genéticos de maneira robusta e barata. Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre o papel biológico de um gene no contexto de um sistema modelo de vertebrados, como a forma como um gene contribui para os processos de desenvolvimento em eucariotos de ordem superior. Com esses procedimentos simples e robustos, o pessoal de laboratório de todos os níveis de experiência, incluindo alunos de graduação, pode realizar modificações genômicas direcionadas no peixe-zebra.
Indivíduos novos neste método devem ser capazes de seguir as instruções passo a passo para identificar alvos genômicos ideais para mutagênese CRISPR, realizar microinjeção de embrião de peixe-zebra e identificar alelos modificados. A demonstração visual desse método é crítica, pois esse método se destina a alunos de graduação que podem não estar familiarizados com uma ou mais das técnicas necessárias. Diretrizes para o design de oligos específicos do modelo para produção de RNA guia são fornecidas no protocolo de texto.
Para começar, suspenda a proteína Cas9 no tampão para gerar uma solução de um miligrama por mililitro. Conservar esta solução em alíquotas prontas para injeção a 80 graus Celsius negativos para utilização posterior. Em seguida, sintetize o sgRNA com um kit de transcrição in vitro como o sugerido nos materiais deste artigo de acordo com as instruções do fabricante.
Purifique o sgRNA sintetizado usando uma precipitação de acetato de amônio livre de RNAse. Adicione 25 microlitros de acetato de amônio de cinco molares ao RNA sintetizado e misture a solução por vórtice. Em seguida, adicione 150 microlitros de etanol livre de nuclease 200 à prova à amostra.
E coloque a reação em um freezer de 80 graus Celsius negativos por pelo menos 20 minutos. Em seguida, centrifugue as amostras na velocidade máxima. Use uma pipeta para remover o sobrenadante tomando cuidado para não perturbar o pellet de RNA.
Em seguida, adicione um mililitro de etanol a 70% e inverta o tubo várias vezes para lavar o sal residual do tubo. Centrifugue novamente na velocidade máxima a quatro graus Celsius por sete minutos. Use uma pipeta P1000 para remover a maior parte da solução.
Em seguida, use uma pipeta P200 para remover o máximo da solução restante sem perturbar o pellet. Tomando cuidado para evitar a contaminação por RNAse, seque o pellet em um espaço limpo até que não haja gotas de líquido visíveis no tubo. Ressuspender o pellet em 30 microlitros de água livre de RNAse e utilizar um espectrofotómetro para quantificar o produto.
Alíquota a solução para armazenamento de longo prazo a 80 graus Celsius negativos. Em seguida, misture 300 a 500 nanogramas de sgRNA com um volume igual de corante de carregamento de gel de RNA 2X. Em seguida, usando uma pipeta P1000, limpe cada um dos poços de gel de agarose de detritos com tampão corrente várias vezes.
Carregue as soluções nos poços de gel de agarose e execute o gel a 10 volts por centímetro por tempo suficiente para separar as bandas de RNA no gel. O tempo pode variar de acordo com o aparelho de eletroforese. Em geral, a frente do corante deve ser executada até 2/3s do comprimento do gel.
Em seguida, use uma coloração de ácido nucleico para visualizar as bandas. O RNA intacto aparece como uma única banda, como nas pistas um e dois mostradas aqui. O RNA degradado é executado como um esfregaço, como na pista três.
Primeiro, prepare os peixes-zebra para reprodução na noite anterior à realização das injeções, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, combine a proteína Cas9 e o sgRNA em uma proporção de dois para um. Incube a solução à temperatura ambiente por cinco minutos enquanto o Cas9 e o sgRNA formam um complexo de ribonucleoproteínas.
Em seguida, adicione 0,5 microlitros de soluções de vermelho de fenol a 2,5% em água livre de RNAse suficiente para atingir um volume final de cinco microlitros. Para preparar a agulha de injeção, use um extrator de micropipeta para puxar um capilar de vidro de um milímetro. Em seguida, corte a ponta da agulha de vidro resultante com uma lâmina de barbear para obter uma abertura angular.
Coloque a agulha em um micromanipulador conectado a um microinjetor. Usando um microscópio óptico, ajuste a pressão de injeção até que a agulha injete consistentemente um nanômetro de solução na placa de Petri. Antes de realizar a microinjeção de embriões, pratique a preparação de agulhas e a injeção de embriões de controle usando uma solução apenas de corante e registre a sobrevivência após 24 horas de desenvolvimento.
Você deve ser capaz de obter mais de 90% de sobrevivência em comparação com um controle não injetado. Em seguida, selecione de 10 a 15 embriões como uma população de controle e coloque-os em uma placa de Petri rotulada separada. Usando uma pipeta de transferência, alinhe cuidadosamente os embriões restantes em uma placa de injeção em temperatura ambiente.
Sob um microscópio de dissecação, injete um nanolitro da solução no saco vitelino de cada embrião. Em seguida, retorne os embriões injetados a uma placa de Petri rotulada e cubra-os com meio 1X E3 com azul de metileno. Coloque os embriões injetados em uma incubadora a 28 graus Celsius por 24 horas.
Em seguida, inspecione os embriões injetados para remover indivíduos mortos ou com desenvolvimento anormal. Primeiro, colete dois conjuntos de cinco embriões de 72 horas das placas contendo embriões injetados e um conjunto de cinco embriões de 72 horas do grupo de controle não injetado nos tubos de microcentrífuga. Pipete suavemente a mídia de cada conjunto de embriões e anestesiá-los.
Remova o anestésico após dois minutos e adicione 45 microlitros de hidróxido de sódio 50 milimolar. Em seguida, incube as amostras a 95 graus por 10 minutos. Em seguida, remova as amostras da incubadora e deixe-as esfriar até a temperatura ambiente.
Adicione cinco microlitros de um cloridrato de tris de pH molar e vortex as amostras vigorosamente. Em seguida, centrifugue a solução na velocidade máxima à temperatura ambiente durante três minutos. Transfira o sobrenadante que contém o DNA genômico para um novo tubo marcado e armazene o gDNA a menos 20 graus Celsius.
Use os primers projetados para amplificar em torno da região alvo do sgRNA, conforme descrito no texto, para amplificar um fragmento de PCR para análise heteroduplex. Use um kit de limpeza de PCR para purificar os produtos da reação de PCR. Diluir as amostras em 30 microlitros de água e usar um espectrofotômetro para quantificar o DNA.
Coloque os tubos contendo os amplicons de PCR em um rack flutuante em banho-maria fervente. Em seguida, prepare um gel TBE de poliacrilamida a 15% usando poliacrilamida a 30%. Depois que o gel endurecer, coloque-o em um aparelho de eletroforese com tampão de execução TBE.
Em seguida, carregue 500 nanogramas dos produtos de PCR recozidos e carregue um controle próximo a cada conjunto de amostras de sgRNA. Execute o gel a 150 volts por duas horas e meia ou até que a frente do corante esteja na parte inferior do gel. Cresça embriões de peixe-zebra injetados até a idade adulta que mostram bandas heteroduplex no HMA.
Para interpretar o HMA, compare a intensidade da banda homoduplex da PCR do controle não injetado do tipo selvagem com as amostras injetadas correspondentes. Se tiver ocorrido um corte suficiente, a intensidade da faixa do peixe injectado deve ser aproximadamente 50% inferior à do controlo de tipo selvagem. Para confirmar a presença de indels em potenciais peixes fundadores fundadores, anestesie os peixes com 0,004% de tricaína e use uma lâmina de barbear limpa para remover 1/2 a 3/4 da barbatana caudal.
Em seguida, coloque a cauda em 45 microlitros de hidróxido de sódio 50 milimolares. Retorne o peixe a um tanque de recuperação e execute a extração de gDNA conforme descrito anteriormente. Em seguida, execute um HMA no gDNA do clipe da cauda para determinar se o indivíduo foi modificado com sucesso pela injeção de CRISPR.
Em seguida, cruze os adultos que exibem bandas heteroduplex no DNA da cauda com peixes do tipo selvagem. Selecione peixes fundadores para gerar peixes F1 com base na análise HMA de piscinas. Finalmente, sequenciar o gDNA do peixe de interesse para caracterizar a natureza do indel.
Após a produção e microinjeção bem-sucedidas de reagentes CRISPR, os embriões de peixe-zebra foram analisados quanto a fenótipos evidentes e formação de indel usando HMA. A formação de indel induzida por Cas9 na tirosinase resulta em perda de pigmentação e é facilmente pontuada 48 horas após a fertilização. A identificação de alelos modificados por CRISPR que não resultam em fenótipos de desenvolvimento evidentes é realizada usando HMA.
O direcionamento bem-sucedido do gene de interesse resulta na formação de bandas heteroduplex e redução da intensidade da banda homoduplex, como nas pistas três e quatro. Não se esqueça de que trabalhar com um organismo vertebrado acarreta responsabilidades éticas. Este protocolo descreve estratégias que minimizam o número de zebrafish necessários para obter um nocaute, um objetivo que deve ser levado em consideração durante a realização deste procedimento.
Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para gerar e identificar rapidamente peixes-zebra portadores de alelos modificados por CRISPR que serão transmitidos na linha germinativa com alta eficiência. É importante ressaltar que essa técnica foi otimizada para ser uma abordagem de baixo custo acessível a alunos de graduação e outros com pouca experiência anterior. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como projetar e implementar facilmente uma abordagem de nocaute genético baseada em CRISPR usando peixe-zebra.