Сохранению молекулярного механизма через эукариот лежит сила с использованием модельных организмов для исследований. Многие из этих систем модели облегчить использование реверс генетических подходов, таких как целевых генов нокауты охарактеризовать вклад продукт гена биологического или болезнь процесс интерес. Джин нарушение методов в организмов, таких как данио рерио исторически полагались на целевых введение фреймшифт мутации, которые обусловлены неточным ремонт DSBs1,2. Когда DSB вводится в геноме, поражения ДНК будет восстановлена через один из двух путей, которые повсеместно присутствуют почти все типы клеток и организмов: не гомологичных конце присоединения (NHEJ) и ориентированные на гомологии ремонт (HDR)3,4 . Неточный характер NHEJ машины часто производит indels различных длин5,6,,78,9. Введение фреймшифт перегласовок в кодирующая последовательность гена может производить преждевременной остановки кодоном, который часто оказывает ген нефункциональным.
Инженерной стратегии раннего генома в zebrafish содействовать indels включены meganucleases, цинка палец nucleases и транскрипции эффекторных активатор как nucleases, все из которых использовали ДНК белковых взаимодействий целевой нуклеиназы к определенному геномной Целевой объект, где он представил14,13,11,12,15, DSB10,. Однако эти технологии часто трудно применять благодаря трудоемким и сложным техники, необходимые для создания Нуклеаза, предназначенный для последовательности ДНК интерес. В отличие от предыдущих стратегий основанный ТРИФОСФАТЫ гена редактирования не полагаться на ДНК белковых взаимодействий для ориентации. Вместо этого связанные ТРИФОСФАТЫ (Cas) эндонуклеазы направлена через РНК руководство, которое использует базовый сопряжения взаимодействий нуклеотидов для целевой геномной сайт интерес16,,1718,19 ,,2021. Благодаря простоте разработки РНК руководство с желаемой спаривание взаимодействий для ориентации его относительно легко ориентироваться эндонуклеазы Cas для желаемого Локус. Тип II ТРИФОСФАТЫ системы в частности широко разработан для редактирования генома приложений благодаря несколько выгодных функций, включая использование единого многодоменных Cas нуклеиназы (Cas9), требующего взаимодействия с ДНК для стимулирования активности эндонуклеазы и использования единого руководства РНК (sgRNA) для его родственных последовательности ДНК18. Последовательность требования, необходимые для нападения на родственных sgRNA, хорошо понимали19, и желаемый sgRNA легко порожденных в vitro транскрипция. Простота и надежность ТРИФОСФАТЫ/Cas9 подход значительно облегчает целевых генетической модификации в данио рерио и широкий спектр других организмов.
Укрепление способности осуществлять что изменения целевых генома в zebrafish вследствие разработки основанный ТРИФОСФАТЫ реагентов значительно увеличить возможность изучать процессы символических позвоночных организмов, таких как развитие центральной нервной системы. Данио рерио геном содержит Ортологи 70% белка кодирование генов в геном человека, а также 84% генов, связанных с заболеваниями в людях22. Данио рерио развития экспонатов несколько ключевых качеств, которые повышают его использования в обратном генетические исследования: эмбрионы закладываются в больших лап, развивать внешне от матери, что делает их поддается генетической манипуляции, микроинъекции и взрослых рыбок данио сексуально зрелых, 3 месяцев, что позволяет для быстрого распространения желаемых линий23.
Доступны многочисленные протоколы, описывающие различные подходы для создания и определения ТРИФОСФАТЫ производные indels в zebrafish24,25,26,27,28,29 ,30,31. Однако многие из этих процедур являются время интенсивного, требуется доступ к дорогостоящим оборудованием и может быть сложным для лабораторий с ограниченным опытом. Шаги, описываемые обеспечивают простой, надежный и экономичный ТРИФОСФАТЫ/Cas9-стратегию инженер данио рерио нокаут линий. Этот протокол описывает использование высокоэффективных комплект синтезировать sgRNAs с помощью ДНК-олигонуклеотиды (oligos), похож на другие подходы, которые были ранее описанных32. Описывается протокол включает два шага, в частности, значительно упростить анализ мутировал ТРИФОСФАТЫ линий: поэтапное использование на основе ПЦР HMA33 легко определить присутствие модификаций генома и анализ последовательности у гетерозиготных мышей данио рерио быстро и легко определить характер несколько indels экономичным образом. Кроме того пошаговые инструкции включены для надежный выбор, надежный добывающих и нагнетательных руководство РНК. Шаги, описанные здесь олицетворяют сравнительно недорогой, надежный протокол, позволяющий лабораторного персонала с широкий спектр опыта вносить идентификации генов нокауты в данио рерио.
Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы выполнить целенаправленное редактирование генома с использованием технологии CRISPR/Cas9 у рыбок данио для создания нокаутов генов надежным и недорогим способом. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о биологической роли гена в контексте модельной системы позвоночных, например, о том, как ген участвует в процессах развития эукариот более высокого порядка. С помощью этих простых и надежных процедур лабораторный персонал с любым уровнем опыта, включая студентов, может выполнять целевые геномные модификации у рыбок данио.
Люди, не знакомые с этим методом, должны быть в состоянии следовать пошаговым инструкциям по определению оптимальных геномных мишеней для мутагенеза CRISPR, выполнению микроинъекции эмбрионов рыбок данио и идентификации модифицированных аллелей. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как он предназначен для студентов, которые могут быть незнакомы с одной или несколькими необходимыми техниками. Рекомендации по проектированию матричных олигосигналов для производства направляющей РНК представлены в текстовом протоколе.
Для начала суспендируйте белок Cas9 в буфере, чтобы получить раствор в концентрации один миллиграмм на миллилитр. Храните этот раствор в готовых инъекциях аликвотах при температуре минус 80 градусов Цельсия для последующего использования. Затем синтезируйте sgРНК с помощью набора для транскрипции in vitro, подобного предложенному в материалах этой статьи, в соответствии с инструкциями производителя.
Очистите синтезированную sgRNA с помощью осаждения свободного ацетата аммония на основе РНКазы. Добавьте к синтезированной РНК 25 микролитров ацетата пяти моляров аммония и перемешайте раствор путем вортексирования. Далее добавьте в образец 150 микролитров этанола без нуклеазы 200 proof.
И поместите реакцию в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов Цельсия минимум на 20 минут. После этого центрифугируйте образцы на максимальной скорости. Используйте пипетку для удаления надосадочной жидкости, стараясь не повредить гранулу РНК.
Затем добавьте один миллилитр 70%-ного этанола и несколько раз переверните трубку, чтобы смыть остатки соли из тюбика. Снова центрифугируйте на максимальной скорости при четырех градусах Цельсия в течение семи минут. Используйте пипетку P1000 для удаления большей части раствора.
Затем с помощью пипетки P200 удалите как можно больше оставшегося раствора, не повреждая гранулу. Стараясь избежать загрязнения РНКазы, высушите гранулу в чистом месте до тех пор, пока в пробирке не останутся видимые капли жидкости. Повторно суспендируйте гранулу в 30 микролитрах воды, свободной от РНКазы, и используйте спектрофотометр для количественного определения продукта.
Аликвот раствор для длительного хранения при температуре минус 80 градусов Цельсия. Затем смешайте от 300 до 500 нанограммов sgRNA с равным объемом 2X красителя, загружающего гель РНК. Затем с помощью пипетки Р1000 несколько раз очистить каждую из отверстий агарозного геля от мусора с помощью работающего буфера.
Загрузите растворы в отверстия для агарозного геля и запустите гель при напряжении 10 вольт на сантиметр в течение времени, достаточного для разделения полос РНК на геле. Время может варьироваться в зависимости от аппарата для электрофореза. Как правило, фронт красителя должен быть растянут на 2/3 длины геля.
Затем используйте краситель для нуклеиновых кислот, чтобы визуализировать полосы. Интактная РНК проявляется в виде одной полосы, как показано на первой и второй полосах. Деградированная РНК протекает в виде мазка, например, на третьей дорожке.
Во-первых, подготовьте данио-рерио к размножению в ночь перед выполнением инъекций, как описано в текстовом протоколе. Затем объедините белок Cas9 и sgRNA в соотношении два к одному. Инкубируйте раствор при комнатной температуре в течение пяти минут, пока Cas9 и sgRNA образуют рибонуклеопротеиновый комплекс.
Затем добавьте 0,5 микролитра 2,5%-ных растворов фенолового красного в воду, не содержащую РНКазы, чтобы достичь конечного объема в пять микролитров. Чтобы подготовить иглу для инъекции, используйте съемник микропипетки, чтобы вытянуть стеклянный капилляр размером в один миллиметр. Затем срежьте кончик получившейся стеклянной иглы лезвием бритвы для получения углового отверстия.
Поместите иглу в микроманипулятор, прикрепленный к микроинъектору. С помощью светового микроскопа регулируйте давление инъекции до тех пор, пока игла не будет последовательно вводить один нанометр раствора в чашку Петри. Перед выполнением микроинъекции эмбриона потренируйтесь в подготовке игл и введении контрольных эмбрионов с использованием раствора только красителя и запишите выживаемость через 24 часа после развития.
Вы должны быть в состоянии достичь выживаемости более 90% по сравнению с контрольной группой без инъекции. Затем выберите от 10 до 15 эмбрионов в качестве контрольной популяции и поместите их в отдельную помеченную чашку Петри. С помощью пипетки для переноса аккуратно выложите оставшиеся эмбрионы на инъекционную пластину комнатной температуры.
Под микроскопом введут по одному нанолитру раствора в желточный мешок каждого эмбриона. Затем верните введенные эмбрионы в меченую чашку Петри и накройте их средой 1X E3 с метиленовым синим. Поместите введенные эмбрионы в инкубатор при температуре 28 градусов Цельсия на 24 часа.
Затем осмотрите введенные эмбрионы, чтобы удалить мертвых или аномально развивающихся особей. Сначала соберите два набора из пяти 72-часовых эмбрионов из планшетов, содержащих введенные эмбрионы, и один набор из пяти 72-часовых эмбрионов из неинъецированной контрольной группы в микроцентрифужные пробирки. Аккуратно удалите пипеткой средства из каждого набора эмбрионов и обезболите их.
Удалите анестетик через две минуты и добавьте 45 микролитров 50 миллимолярного гидроксида натрия. Затем инкубируйте образцы при температуре 95 градусов в течение 10 минут. Далее достаньте образцы из инкубатора и дайте им остыть до комнатной температуры.
Добавьте пять микролитров одного молярного pH трис гидрохлорида и энергично перебейте образцы. Затем центрифугируйте раствор на максимальной скорости при комнатной температуре в течение трех минут. Перенесите надосадочную жидкость, содержащую геномную ДНК, в новую меченую пробирку и храните гДНК при температуре минус 20 градусов Цельсия.
Используйте праймеры, предназначенные для амплификации вокруг целевой области sgРНК, как описано в тексте, для амплификации фрагмента ПЦР для гетеродуплексного анализа. Используйте набор для очистки ПЦР для очистки продуктов ПЦР-реакции. Разведите образцы в 30 микролитрах воды и используйте спектрофотометр для количественного определения ДНК.
Поместите пробирки с ампликонами ПЦР в плавающую решетку на кипящей водяной бане. Затем приготовьте 15% полиакриламидный гель TBE, используя 30% полиакриламида. После того как гель схватится, поместите его в аппарат для электрофореза с рабочим буфером TBE.
Затем загрузите 500 нанограммов повторно отожженных продуктов ПЦР и загрузите контрольный элемент рядом с каждым набором образцов sgRNA. Запускайте гель при напряжении 150 вольт в течение двух с половиной часов или до тех пор, пока фронт красителя не окажется в нижней части геля. Вырастите инъекционные эмбрионы данио-рерио до взрослого возраста, которые демонстрируют гетеродуплексные полосы в HMA.
Чтобы интерпретировать HMA, сравните интенсивность гомодуплексной полосы из ПЦР неинъецируемого контроля дикого типа с соответствующими инъецируемыми образцами. Если произошла достаточная резка, интенсивность полосы от инъецируемой рыбы должна быть примерно на 50% ниже, чем у контроля дикого типа. Чтобы подтвердить наличие инделов у потенциальных родительских рыб-основателей, обезболите рыбу 0,004% трикаином и с помощью чистого бритвенного лезвия удалите от 1/2 до 3/4 хвостового плавника.
Затем поместите хвост в 45 микролитров 50 миллимолярного гидроксида натрия. Верните рыбу в резервуар для восстановления и выполните экстракцию гДНК, как описано выше. Затем выполните HMA на гДНК хвостового зажима, чтобы определить, была ли особь успешно модифицирована с помощью инъекции CRISPR.
Затем разводите взрослых особей, которые демонстрируют гетеродуплексные полосы в ДНК хвоста, с рыбами дикого типа. Выберите рыбу-основателя для генерации рыбы F1 на основе анализа пулов HMA. Наконец, секвенируйте гДНК интересующей рыбы, чтобы охарактеризовать природу инделя.
После успешного производства и микроинъекции реагентов CRISPR эмбрионы рыбок данио были проанализированы на явные фенотипы и образование инделов с использованием HMA. Индуцированное Cas9 образование инделя на тирозиназе приводит к потере пигментации и легко обнаруживается через 48 часов после оплодотворения. Идентификация модифицированных CRISPR аллелей, которые не приводят к явным фенотипам развития, выполняется с помощью HMA.
Успешное нацеливание на интересующий ген приводит к образованию гетеродуплексных полос и снижению интенсивности гомодуплексной полосы, например, на третьей и четвертой полосах. Не забывайте, что работа с позвоночным организмом несет этическую ответственность. Этот протокол описывает стратегии, которые минимизируют количество рыбок данио, необходимое для получения нокаута, цель, которую следует учитывать при выполнении этой процедуры.
После освоения этот метод может быть использован для быстрого создания и идентификации рыбок данио-рерио, несущих модифицированные CRISPR аллели, которые будут передаваться в зародышевой линии с высокой эффективностью. Важно отметить, что этот метод был оптимизирован для того, чтобы быть недорогим подходом, подходящим для студентов и других лиц с небольшим предыдущим опытом. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как легко разработать и реализовать подход к нокауту генов на основе CRISPR с использованием рыбок данио.