Ökaryotlar arasında Moleküler makineler korunması için araştırma model organizmalar kullanarak güç altında yatan. Bu modeli sistemlerin pek çok gen ürünü bir biyolojik veya hastalık işleme ilgi katkısını karakterize etmek için hedeflenen gen altını gizleme gibi ters genetik yaklaşımlar kullanımını kolaylaştırmak. Gene bozulma teknikleri zebra balığı gibi organizmalar üzerinde DSBs¹^,²imprecise tamiri neden frameshift mutasyonların hedeflenen giriş tarihsel yararlanmıştır. Bir DSB genom tanıttığında, DNA lezyon neredeyse tüm hücre tipleri ve organizmaların evrensel olarak mevcut iki yolları biri aracılığıyla tamir: homolog olmayan sonu (NHEJ) katılma ve Homoloji yönetmen onarım (HDR)³^,⁴. NHEJ makine imprecise doğası sık sık çeşitli uzunlukları⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹indels üretir. Giriş bir genin kodlama dizisi frameshift mutasyonların kez gen işlevsel olmayan işler bir erken kodonu, üretebilir.

Meganucleases, çinko-parmak nükleaz ve transkripsiyon harekete geçirmek gibi efektör nükleaz, tüm bunların bir nükleaz genomik belirli bir hedef için DNA-protein etkileşimler kullanılan zebra balığı indels tanıtmak için erken genom mühendislik stratejileri dahil hedef nerede DSB¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵tanıttı. Ancak, bu teknolojilerin genellikle faiz DNA dizisi hedefleyen bir nükleaz görüntüyü artırmak için gerekli zahmetli ve karmaşık mühendislik nedeniyle uygulamak zordur. Önceki stratejileri gen CRISPR tabanlı düzenleme hedefleme için protein-DNA etkileşimleri dayanmaz. Bunun yerine, CRISPR ilişkili (Cas) endonükleaz nükleotit etkileşimleri eşleştirme temel faiz¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,^{19 genomik bir site hedeflemek için kullandığı bir RNA Kılavuzu yönlendirilir} ^,²⁰^,²¹. Bir RNA tasarlama basitliği nedeniyle Kılavuzu ile etkileşimleri bu hedefleme için eşleştirme istenen Bankası Cas endonükleaz istenen odağı için hedef nispeten kolaydır. Tip II CRISPR sistemi özellikle yaygın endonükleaz etkinliği uyarmak için DNA ile etkileşim gerektiren bir tek etki alanlı Cas nükleaz (Cas9) kullanımı da dahil olmak üzere birçok avantajlı özellikleri nedeniyle genom düzenleme uygulamaları için geliştirilmiştir ve soydaş DNA dizisi¹⁸için hedef için bir tek Kılavuzu RNA (sgRNA) kullanın. Sıra gereksinimleri soydaş sgRNA hedefleme için gerekli iyi anlaşılan¹⁹, ve istenen sgRNA kolayca vitro transkripsiyon tarafından oluşturulur. Sadelik ve sağlamlık CRISPR/Cas9 yaklaşımın büyük zebra balığı ve diğer organizmalar zengin çeşitte hedeflenen genetik değişiklik kolaylaştırır.

Zebra balığı reaktifler CRISPR tabanlı geliştirme sonucu olarak hedeflenen genom düzenleme önemli ölçüde vardır taahhüt yeteneği gelişmiş omurgalı canlıların sinir merkezi geliştirme gibi sembolik işlemler çalışma fırsatı arttı sistem. Zebra balığı genom orthologs insan genomu hem de insanlar²²hastalıkları ile ilişkili genlerin % 84 bulundu protein kodlayıcı genlerin % 70 içerir. Zebra balığı geliştirme sergileyen kullanımı ters genetik çalışmalarda geliştirmek birkaç anahtar nitelikler: embriyo büyük debriyajlar koyulur, dışarıdan mikroenjeksiyon ve yetişkin zebra balığı tarafından mükellef genetik manipülasyon geliştirmelerde anneden geliştirmek 3 ay-in yaş, istediğiniz satırları²³hızlı yayılması için izin tarafından cinsel olgun.

Çok sayıda iletişim kurallarının yaklaşımlar oluşturmak ve CRISPR elde edilen indels zebra balığı²⁴^,²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,^{29 olarak tanımlamak için çeşitli tarif} ^,³⁰^,³¹. Ancak, bu yordamları birçoğu zaman yoğun, pahalı ekipmanlara erişim gerektiren ve labs ile sınırlı uzmanlık için zor olabilir. Burada açıklanan adımları bir basit, sağlam ve ekonomik CRISPR/Cas9-stratejisi mühendis zebra balığı nakavt satırlarına sağlayabilir. Bu iletişim kuralı DNA oligonucleotides (oligos) kullanarak sgRNAs sentezlemek için son derece verimli bir kit açıklar, benzer olmuştur diğer yaklaşımlar için daha önce açıklanan³². Açıklanan protokol iki adımları özellikle büyük ölçüde kolaylaştıran çizgiler CRISPR mutasyona uğramış analizini içerir: adım adım kolayca genom değişiklikler varlığı ve sıralama Analizi belirlemek için PCR tabanlı HMA³³ kullanımı hızla ve kolayca birden çok indels ekonomik bir biçimde sebebini bulmaya Heterozigoz zebra balığı. Buna ek olarak, adım adım yönergeler seçimi sağlam, güvenilir üretim ve Enjeksiyon Kılavuzu RNA'ların için dahil edilir. Burada sağlanan adımlar zebra balığı gen knockouts tanımlaması için katkıda bulunmak laboratuar personeli uzmanlık bir dizi sağlayan sağlam, nispeten ucuz protokol örnekler.

Bu prosedürün genel amacı, zebra balığında CRISPR / Cas9 teknolojisini kullanarak gen nakavtlarını sağlam ve ucuz bir şekilde tasarlamak için hedefli genom düzenlemesi yapmaktır. Bu yöntem, bir genin daha yüksek dereceli ökaryotlarda gelişimsel süreçlere nasıl katkıda bulunduğu gibi, bir omurgalı model sistemi bağlamında bir genin biyolojik rolü hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu basit ve sağlam prosedürlerle, lisans öğrencileri de dahil olmak üzere her deneyim seviyesindeki laboratuvar personeli, zebra balıklarında hedeflenen genomik modifikasyonları gerçekleştirebilir.

Bu yönteme yeni olan kişiler, CRISPR mutajenezi için en uygun genomik hedefleri belirlemek, zebra balığı embriyo mikroenjeksiyonu yapmak ve modifiye alelleri tanımlamak için adım adım talimatları takip edebilmelidir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir, çünkü bu yöntem gerekli tekniklerden bir veya daha fazlasına aşina olmayan lisans öğrencileri için tasarlanmıştır. Kılavuz RNA üretimi için şablona özgü oligoların tasarımı için yönergeler metin protokolünde verilmiştir.

Başlamak için, mililitre başına bir miligram çözelti oluşturmak için Cas9 proteinini tamponda askıya alın. Bu solüsyonu daha sonra kullanmak üzere eksi 80 santigrat derecede enjeksiyona hazır alikotlarda saklayın. Daha sonra sgRNA'yı, üreticinin talimatlarına göre bu makalenin materyallerinde önerildiği gibi bir in vitro transkripsiyon kiti ile sentezleyin.

Sentezlenen sgRNA'yı RNAse içermeyen bir amonyum asetat çökeltmesi kullanarak saflaştırın. Sentezlenen RNA'ya 25 mikrolitre beş molar amonyum asetat ekleyin ve çözeltiyi girdaplama ile karıştırın. Daha sonra, numuneye 150 mikrolitre 200 geçirmez nükleaz içermeyen etanol ekleyin.

Ve reaksiyonu en az 20 dakika boyunca eksi 80 santigrat derece dondurucuya koyun. Daha sonra numuneleri maksimum hızda santrifüjleyin. RNA peletini rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı çıkarmak için bir pipet kullanın.

Daha sonra bir mililitre% 70 etanol ekleyin ve tüpten kalan tuzu yıkamak için tüpü birkaç kez ters çevirin. Yedi dakika boyunca dört santigrat derecede maksimum hızda tekrar santrifüjleyin. Solüsyonun çoğunu çıkarmak için bir P1000 pipeti kullanın.

Ardından, peleti bozmadan kalan çözeltinin mümkün olduğunca fazlasını çıkarmak için bir P200 pipeti kullanın. RNAse kontaminasyonunu önlemeye özen göstererek, tüpte sıvı damlası görünmeyene kadar peleti temiz bir alanda kurutun. Peletleri 30 mikrolitre RNAse içermeyen suda yeniden süspanse edin ve ürünü ölçmek için bir spektrofotometre kullanın.

Eksi 80 santigrat derecede uzun süreli depolama için çözeltiyi destekleyin. Daha sonra 300 ila 500 nanogram sgRNA'yı eşit hacimde 2X RNA jel yükleme boyası ile karıştırın. Ardından, bir P1000 pipeti kullanarak, agaroz jel kuyucuklarının her birini birkaç kez çalışan tamponla temizleyin.

Çözeltileri agaroz jel kuyucuklarına yükleyin ve jel üzerindeki RNA bantlarını ayırmak için yeterli süre boyunca jeli santimetre başına 10 voltta çalıştırın. Süre, elektroforez cihazına göre değişebilir. Genel olarak, boya cephesi jelin uzunluğunun 2 / 3'üne kadar çalıştırılmalıdır.

Ardından bantları görselleştirmek için bir nükleik asit boyası kullanın. Bozulmamış RNA, burada gösterilen birinci ve ikinci şeritte olduğu gibi tek bir bant olarak görünür. Bozulmuş RNA, üçüncü şeritte olduğu gibi bir yayma olarak çalışır.

İlk olarak, zebra balığı deneklerini metin protokolünde açıklandığı gibi enjeksiyonları gerçekleştirmeden önceki gece üreme için hazırlayın. Daha sonra Cas9 proteini ve sgRNA'yı ikiye bir oranında birleştirin. Cas9 ve sgRNA bir ribonükleoprotein kompleksi oluştururken, çözeltiyi oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Daha sonra, beş mikrolitrelik bir nihai hacim elde etmek için yeterli RNAse içermeyen suya 0,5 mikrolitre %2,5 fenol kırmızı çözelti ekleyin. Enjeksiyon iğnesini hazırlamak için, bir milimetrelik cam kılcal damarı çekmek için bir mikropipet çektirme kullanın. Daha sonra açılı bir açıklık elde etmek için elde edilen cam iğnenin ucunu bir tıraş bıçağıyla kesin.

İğneyi bir mikroenjektöre bağlı bir mikromanipülatöre yerleştirin. Bir ışık mikroskobu kullanarak, iğne Petri kabına tutarlı bir şekilde bir nanometre çözelti enjekte edene kadar enjeksiyon basıncını ayarlayın. Embriyo mikroenjeksiyonu yapmadan önce, iğneler hazırlama ve sadece boya çözeltisi kullanarak kontrol embriyolarını enjekte etme alıştırması yapın ve gelişimden 24 saat sonra hayatta kalmayı kaydedin.

Enjekte edilmemiş bir kontrole kıyasla% 90'dan fazla hayatta kalma elde edebilmelisiniz. Daha sonra, kontrol popülasyonu olarak 10 ila 15 embriyo seçin ve bunları ayrı bir etiketli Petri kabına yerleştirin. Bir transfer pipeti kullanarak, kalan embriyoları oda sıcaklığında bir enjeksiyon plakasına dikkatlice hizalayın.

Bir diseksiyon mikroskobu altında, çözeltinin bir nanolitresini her embriyonun yumurta sarısı kesesine enjekte edin. Daha sonra enjekte edilen embriyoları etiketli bir Petri kabına geri koyun ve üzerlerini metilen mavisi içeren 1X E3 ortamı ile kaplayın. Enjekte edilen embriyoları 24 saat boyunca 28 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin.

Ardından, ölü veya anormal şekilde gelişen bireyleri çıkarmak için enjekte edilen embriyoları inceleyin. İlk olarak, enjekte edilen embriyoları içeren plakalardan iki set 72 saatlik embriyo ve enjekte edilmemiş kontrol grubundan bir set 72 saatlik beş embriyoyu mikrosantrifüj tüplerine toplayın. Her embriyo setinden ortamı nazikçe pipetleyin ve uyuşturun.

Anesteziyi iki dakika sonra çıkarın ve 45 mikrolitre 50 milimolar sodyum hidroksit ekleyin. Daha sonra numuneleri 95 derecede 10 dakika inkübe edin. Ardından, numuneleri inkübatörden çıkarın ve oda sıcaklığına soğumalarını bekleyin.

Beş mikrolitre bir molar pH tris hidroklorür ekleyin ve numuneleri kuvvetlice girdaplayın. Daha sonra çözeltiyi oda sıcaklığında maksimum hızda üç dakika santrifüjleyin. Genomik DNA'yı içeren süpernatanı yeni bir etiketli tüpe aktarın ve gDNA'yı eksi 20 santigrat derecede saklayın.

Heterodupleks analiz için bir PCR fragmanını amplifiye etmek için metinde açıklandığı gibi sgRNA hedef bölgesinin etrafını amplifiye etmek üzere tasarlanmış primerleri kullanın. PCR reaksiyonunun ürünlerini saflaştırmak için bir PCR temizleme kiti kullanın. Numuneleri 30 mikrolitre su ile seyreltin ve DNA'yı ölçmek için bir spektrofotometre kullanın.

PCR amplikonları içeren tüpleri kaynar su banyosunda yüzen bir rafa yerleştirin. Ardından, %30 poliakrilamid kullanarak %15'lik bir poliakrilamid TBE jeli hazırlayın. Jel sertleştikten sonra, TBE çalışma tamponu olan bir elektroforez aparatına yerleştirin.

Ardından 500 nanogram yeniden tavlanmış PCR ürünü yükleyin ve her bir sgRNA numunesi setinin yanına bir kontrol yükleyin. Jeli 150 voltta iki buçuk saat veya boya önü jelin dibine gelene kadar çalıştırın. HMA'da heterodubleks bantlar gösteren enjekte edilmiş zebra balığı embriyolarını yetişkinliğe kadar büyütün.

HMA'yı yorumlamak için, vahşi tip enjekte edilmemiş kontrolün PCR'sinden homodubleks bandın yoğunluğunu karşılık gelen enjekte edilen numunelerle karşılaştırın. Yeterli kesim meydana gelmişse, enjekte edilen balıktan gelen bandın yoğunluğu, yabani tip kontrolünden yaklaşık% 50 daha düşük olmalıdır. Potansiyel kurucu ebeveyn balıklarında indellerin varlığını doğrulamak için, balığı %0.004 trisaf içinde uyuşturun ve kuyruk yüzgecinin 1/2 ila 3/4'ünü çıkarmak için temiz bir tıraş bıçağı kullanın.

Ardından kuyruğu 45 mikrolitre 50 milimolar sodyum hidroksit içine yerleştirin. Balıkları bir geri kazanım tankına geri koyun ve daha önce açıklandığı gibi gDNA ekstraksiyonunu gerçekleştirin. Ardından, bireyin CRISPR enjeksiyonu ile başarılı bir şekilde değiştirilip değiştirilmediğini belirlemek için kuyruk klipsi gDNA üzerinde bir HMA gerçekleştirin.

Daha sonra kuyruk DNA'sında heterodubleks bantlar sergileyen yetişkinleri vahşi tip balıklara yetiştirin. Havuzların HMA analizine dayalı olarak F1 balığı oluşturmak için kurucu balıkları seçin. Son olarak, indel'in doğasını karakterize etmek için ilgilenilen balığın gDNA'sını sıralayın.

CRISPR reaktiflerinin başarılı bir şekilde üretilmesi ve mikroenjeksiyonunun ardından, zebra balığı embriyoları HMA kullanılarak açık fenotipler ve indel oluşumu açısından analiz edildi. Tirozinazda Cas9'un neden olduğu indel oluşumu pigmentasyon kaybına neden olur ve döllenmeden 48 saat sonra kolayca puanlanır. Açık gelişimsel fenotiplerle sonuçlanmayan CRISPR modifiye alellerinin tanımlanması HMA kullanılarak gerçekleştirilir.

İlgilenilen genin başarılı bir şekilde hedeflenmesi, heterodubleks bantların oluşumuna ve üçüncü ve dördüncü şeritlerde olduğu gibi homodubleks bandın yoğunluğunun azalmasına neden olur. Omurgalı bir organizma ile çalışmanın etik sorumluluklar taşıdığını unutmayın. Bu protokol, bu prosedürü gerçekleştirirken dikkate alınması gereken bir hedef olan nakavt elde etmek için gereken zebra balığı sayısını en aza indiren stratejileri açıklar.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, germ hattında yüksek verimlilikle iletilecek CRISPR modifiye alelleri taşıyan zebra balıklarını hızlı bir şekilde oluşturmak ve tanımlamak için kullanılabilir. Daha da önemlisi, bu teknik, lisans öğrencileri ve daha önce çok az deneyimi olan diğer kişiler için uygun olan düşük maliyetli bir yaklaşım olacak şekilde optimize edilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, zebra balığı kullanarak CRISPR tabanlı bir gen nakavt yaklaşımının nasıl kolayca tasarlanacağını ve uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız.

Verimli üretim ve Model sistem <em>Danio rerio</em> kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme