Overview
Förster 공명 에너지 전송 (FRET) 근거리 생화학 적 상호 작용을 조사하는 데 사용되는 현상이다. FRET에서, 기증자 광발광분자는 각각의 방출 및 흡수 스펙트럼이 겹치는 경우에 비 라디아케로 에너지를 수용자 분자로 비-방사적으로 전송할 수 있습니다. 전달된 에너지의 양 - 그리고 결과적으로 샘플의 전반적인 방출은 수용자 기증자 쌍의 광발광성 분자의 근접에 달려 있습니다. FRET 분석은 이 "분광 눈자"에서 생분자 구조 및 상호 작용의 상세한 정보를 얻기 위하여 그밖 생화학 기술과 결합됩니다.
이 비디오는 FRET 분석의 원칙과 개념을 다룹니다. 이 절차는 FRET에 대한 샘플을 준비하고 데이터를 표시하고 해석하는 방법에 중점을 둡니다. 마지막으로, 응용 프로그램은 세포 또는 단백질의 일부를 라벨링하여 형성 및 세포 과정을 모니터링, 단백질 구조를 변경하는 효소 반응을 모니터링하고, FRET를 사용하여 세포에 의해 발현된 단량체의 응집을 모니터링하는 것을 포함한다.
Förster 공명 에너지 전송, 또는 FRET, 발광 분자 사이 에너지의 비 방사성 전송, 그리고 종종 근거리 생화학 상호 작용을 조사 하는 데 사용 됩니다. FRET는 형광 분자가 서로의 10 nm 이내에 간격을 두면 발생합니다. FRET 분석은 상세한 구조 정보를 얻기 위해 다른 기술과 결합 될 수있다. 이 비디오는 FRET의 기본 원칙을 소개하고 프로토콜 및 데이터 프레젠테이션을 요약하고 일부 생화학 적 응용 프로그램에 대해 논의합니다.
형광소와 같은 광발성 분자는 흡수 스펙트럼에서 파장에서 전자기 방사선을 흡수하여 흥분합니다. 이완되면 방출 스펙트럼 내의 파장에서 빛을 방출합니다. 형광에 대한 자세한 내용은 형광 현미경 검사법에 대한 JoVE의 비디오를 참조하십시오. 다른 형광은 자주 겹치는 다른 파장에서 빛을 흡수하고 방출합니다. 형광의 방출 스펙트럼이 다른 형광의 흡수 스펙트럼과 크게 겹치는 경우, "기증자"는 "수용자"에 의해 흡수되는 가상 광을 방출합니다. 흥분 된 기증자가 수용자의 10 nm 이내일 때, 에너지는 이폴 이폴 상호 작용에 의해 기증자에서 수락으로 옮겨질 것입니다. 기증자로부터 빛의 방출에 의한 에너지 방출은 그에 상응하는 감소합니다. 한편, 흥분 된 수용자는 방출 파장에서 빛을 방출합니다. FRET 반응은 형광 또는 기타 방사성 공정보다는 FRET에 의해 기증자로부터 방출되는 에너지의 비율 또는 효율성 측면에서 평가됩니다. 효율성은 FRET가 '분자' 또는 '분광' 통치자역할을 할 수 있도록 기증자와 수용자 사이의 거리에 크게 좌우됩니다.
생화학에서 FRET는 서로의 FRET 범위 안팎으로 이동하는 형광을 모니터링하여 분자의 형성 적 변화를 관찰하기 위해 질적으로 사용됩니다. 유사하게, 세포 기능은 FRET 쌍을 포함하는 분자로 공부될 수 있습니다. 표지된 분자가 효소 활성에 의해 갈라지면 FRET가 멈추고 관찰된 형광 파장이 변합니다.
이제 FRET의 원리를 이해하게 되었으므로 프로토콜에 대한 개요와 데이터를 표시하고 해석하는 몇 가지 방법을 살펴보겠습니다.
실험에 앞서, 관심있는 생체 분자, 전형적으로 DNA 또는 단백질은 분자 생물학 기술을 사용하여 형광 태그로 설계됩니다. 세포내로 변형된 유전 물질을 도입하는 일반적인 방법은 경질 및 전기기질을 포함한다.
이어서, 세포는 형광 현미경에 FRET 시각화를 위해 준비됩니다. 예를 들어, 분자는 단일 분자 FRET를 위한 슬라이드에 고정될 수 있거나, 샘플은 고처리량 스크리닝을 위해 우물에 적재될 수 있다.
이어서, 흥분 레이저, 현미경 및 관련 장비가 준비됩니다. (A) FRET 실험은 종종 강력한 레이저를 포함한다; (B) 적절한 PPE 및 안전 절차를 사용해야 합니다. 샘플은 계측기에 배치하고 흥분 레이저로 조명됩니다.
세포 동작을 모니터링하는 실험의 경우 방출 강도의 차이 또는 변화를 보여주는 색상 이미지가 사용됩니다. 기증자 및 수락자 방출 강도는 시간이 지남에 따라 FRET 응답을 추적하기 위해 함께 플롯됩니다.
또한 보다 복잡한 분석을 위해 다양한 기능에 FRET 데이터를 장착할 수도 있습니다. 실험에 따라 결과를 가장 잘 나타내는 여러 가지 방법으로 데이터가 표시되어 FRET를 유연한 실험 도구로 만들 수 있습니다.
이제 FRET 실험을 실행하고 분석하는 기본 사항에 익숙해졌으니 생화학 연구에서 FRET의 일부 응용 프로그램을 살펴보겠습니다.
FRET는 FRET 쌍으로 서로의 10 nm 내에서 이동할 것으로 예상되는 단백질 또는 세포의 일부를 라벨링하여 형성 적 변화 또는 세포 과정을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 단백질 센서는 한 쌍의 형광으로 수용체에 라벨을 부착하여 제조됩니다. FRET 반응은 공초점 현미경 검사법에 의해 실시간으로 모니터링됩니다. 방출 파장 및 강도의 변화는 변형 변화를 나타냅니다.
FRET는 또한 활성 FRET 쌍으로 분자를 준비하고 반응의 변화를 관찰함으로써 사용될 수 있습니다. 기판이 절단되면 FRET가 중단되어 기증자 방출이 증가하고 수용자 방출이 감소합니다. 배출량은 기부자, 수락자 및 FRET의 기여를 결정하기 위해 분석됩니다. 직접 방출 인자가 시안 및 황형 광원 단백질에 대해 계산되면 기판의 농도 및 운동 파라미터가 결정될 수 있다.
FRET 쌍 중 하나를 포함하는 단조체를 표현하도록 설계된 셀은 이러한 단조체 간의 상호 작용을 위한 '센서'로 작동합니다. 이러한 단량제의 집계가 유도되면 FRET 응답이 관찰됩니다. 이것은 잘못 접힌 단백질의 '파종'에 의해 시작된 단백질 집계를 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다. 여기서, 세포는 관심있는 단백질의 응집체로 변환되고, 배양되고, 유동 세포측정으로 분석하였다.
당신은 Förster 공명 에너지 전송에 조브의 비디오를 보았다, 또는 FRET. 이 비디오에는 FRET의 기본 원리, FRET 실험의 준비 및 분석 및 몇 가지 생화학 적 응용 프로그램이 포함되어 있습니다.
시청해 주셔서 감사합니다!
Procedure
Förster 공명 에너지 전송 (FRET) 근거리 생화학 적 상호 작용을 조사하는 데 사용되는 현상이다. FRET에서, 기증자 광발광분자는 각각의 방출 및 흡수 스펙트럼이 겹치는 경우에 비 라디아케로 에너지를 수용자 분자로 비-방사적으로 전송할 수 있습니다. 전달된 에너지의 양 - 그리고 결과적으로 샘플의 전반적인 방출은 수용자 기증자 쌍의 광발광성 분자의 근접에 달려 있습니다. FRET 분석은 이 "분광 눈자"에서 생분자 구조 및 상호 작용의 상세한 정보를 얻기 위하여 그밖 생화학 기술과 결합됩니다.
이 비디오는 FRET 분석의 원칙과 개념을 다룹니다. 이 절차는 FRET에 대한 샘플을 준비하고 데이터를 표시하고 해석하는 방법에 중점을 둡니다. 마지막으로, 응용 프로그램은 세포 또는 단백질의 일부를 라벨링하여 형성 및 세포 과정을 모니터링, 단백질 구조를 변경하는 효소 반응을 모니터링하고, FRET를 사용하여 세포에 의해 발현된 단량체의 응집을 모니터링하는 것을 포함한다.
Förster 공명 에너지 전송, 또는 FRET, 발광 분자 사이 에너지의 비 방사성 전송, 그리고 종종 근거리 생화학 상호 작용을 조사 하는 데 사용 됩니다. FRET는 형광 분자가 서로의 10 nm 이내에 간격을 두면 발생합니다. FRET 분석은 상세한 구조 정보를 얻기 위해 다른 기술과 결합 될 수있다. 이 비디오는 FRET의 기본 원칙을 소개하고 프로토콜 및 데이터 프레젠테이션을 요약하고 일부 생화학 적 응용 프로그램에 대해 논의합니다.
형광소와 같은 광발성 분자는 흡수 스펙트럼에서 파장에서 전자기 방사선을 흡수하여 흥분합니다. 이완되면 방출 스펙트럼 내의 파장에서 빛을 방출합니다. 형광에 대한 자세한 내용은 형광 현미경 검사법에 대한 JoVE의 비디오를 참조하십시오. 다른 형광은 자주 겹치는 다른 파장에서 빛을 흡수하고 방출합니다. 형광의 방출 스펙트럼이 다른 형광의 흡수 스펙트럼과 크게 겹치는 경우, "기증자"는 "수용자"에 의해 흡수되는 가상 광을 방출합니다. 흥분 된 기증자가 수용자의 10 nm 이내일 때, 에너지는 이폴 이폴 상호 작용에 의해 기증자에서 수락으로 옮겨질 것입니다. 기증자로부터 빛의 방출에 의한 에너지 방출은 그에 상응하는 감소합니다. 한편, 흥분 된 수용자는 방출 파장에서 빛을 방출합니다. FRET 반응은 형광 또는 기타 방사성 공정보다는 FRET에 의해 기증자로부터 방출되는 에너지의 비율 또는 효율성 측면에서 평가됩니다. 효율성은 FRET가 '분자' 또는 '분광' 통치자역할을 할 수 있도록 기증자와 수용자 사이의 거리에 크게 좌우됩니다.
생화학에서 FRET는 서로의 FRET 범위 안팎으로 이동하는 형광을 모니터링하여 분자의 형성 적 변화를 관찰하기 위해 질적으로 사용됩니다. 유사하게, 세포 기능은 FRET 쌍을 포함하는 분자로 공부될 수 있습니다. 표지된 분자가 효소 활성에 의해 갈라지면 FRET가 멈추고 관찰된 형광 파장이 변합니다.
이제 FRET의 원리를 이해하게 되었으므로 프로토콜에 대한 개요와 데이터를 표시하고 해석하는 몇 가지 방법을 살펴보겠습니다.
실험에 앞서, 관심있는 생체 분자, 전형적으로 DNA 또는 단백질은 분자 생물학 기술을 사용하여 형광 태그로 설계됩니다. 세포내로 변형된 유전 물질을 도입하는 일반적인 방법은 경질 및 전기기질을 포함한다.
이어서, 세포는 형광 현미경에 FRET 시각화를 위해 준비됩니다. 예를 들어, 분자는 단일 분자 FRET를 위한 슬라이드에 고정될 수 있거나, 샘플은 고처리량 스크리닝을 위해 우물에 적재될 수 있다.
이어서, 흥분 레이저, 현미경 및 관련 장비가 준비됩니다. (A) FRET 실험은 종종 강력한 레이저를 포함한다; (B) 적절한 PPE 및 안전 절차를 사용해야 합니다. 샘플은 계측기에 배치하고 흥분 레이저로 조명됩니다.
세포 동작을 모니터링하는 실험의 경우 방출 강도의 차이 또는 변화를 보여주는 색상 이미지가 사용됩니다. 기증자 및 수락자 방출 강도는 시간이 지남에 따라 FRET 응답을 추적하기 위해 함께 플롯됩니다.
또한 보다 복잡한 분석을 위해 다양한 기능에 FRET 데이터를 장착할 수도 있습니다. 실험에 따라 결과를 가장 잘 나타내는 여러 가지 방법으로 데이터가 표시되어 FRET를 유연한 실험 도구로 만들 수 있습니다.
이제 FRET 실험을 실행하고 분석하는 기본 사항에 익숙해졌으니 생화학 연구에서 FRET의 일부 응용 프로그램을 살펴보겠습니다.
FRET는 FRET 쌍으로 서로의 10 nm 내에서 이동할 것으로 예상되는 단백질 또는 세포의 일부를 라벨링하여 형성 적 변화 또는 세포 과정을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 단백질 센서는 한 쌍의 형광으로 수용체에 라벨을 부착하여 제조됩니다. FRET 반응은 공초점 현미경 검사법에 의해 실시간으로 모니터링됩니다. 방출 파장 및 강도의 변화는 변형 변화를 나타냅니다.
FRET는 또한 활성 FRET 쌍으로 분자를 준비하고 반응의 변화를 관찰함으로써 사용될 수 있습니다. 기판이 절단되면 FRET가 중단되어 기증자 방출이 증가하고 수용자 방출이 감소합니다. 배출량은 기부자, 수락자 및 FRET의 기여를 결정하기 위해 분석됩니다. 직접 방출 인자가 시안 및 황형 광원 단백질에 대해 계산되면 기판의 농도 및 운동 파라미터가 결정될 수 있다.
FRET 쌍 중 하나를 포함하는 단조체를 표현하도록 설계된 셀은 이러한 단조체 간의 상호 작용을 위한 '센서'로 작동합니다. 이러한 단량제의 집계가 유도되면 FRET 응답이 관찰됩니다. 이것은 잘못 접힌 단백질의 '파종'에 의해 시작된 단백질 집계를 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다. 여기서, 세포는 관심있는 단백질의 응집체로 변환되고, 배양되고, 유동 세포측정으로 분석하였다.
당신은 Förster 공명 에너지 전송에 조브의 비디오를 보았다, 또는 FRET. 이 비디오에는 FRET의 기본 원리, FRET 실험의 준비 및 분석 및 몇 가지 생화학 적 응용 프로그램이 포함되어 있습니다.
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Disclosures
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
