Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Biochemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

תהודה פלסמון פני השטח (SPR)
 
Click here for the English version

תהודה פלסמון פני השטח (SPR)

Overview

תהודה פלסמון פני השטח (SPR) היא התופעה האופטית הבסיסית מאחורי biosensors ללא תוויות כדי להעריך את הזיקה המולקולרית, הקינטיקה, הספציפיות, וריכוז של biomolecules. ב- SPR, אינטראקציות ביומולקולריות מתרחשות על biosensor עשוי שכבה דקה של מתכת על פריזמה. אינטראקציות בזמן אמת של biomolecules ניתן לפקח על ידי מדידת השינויים של אור משתקף את החלק התחתון של המתכת.

וידאו זה מתאר את המושגים הבסיסיים של SPR וכיצד הוא משמש לניתוח והדמיה של אינטראקציות ביומולקולריות. לאחר מכן הכנה מדגם ופרוטוקול ניסיוני לחקירת שיעורי כריכה באמצעות SPR. בסעיף היישומים, הדמיית SPR, SPR מקומי ו- SPR משופר נקודה קוונטית נחקרים.

תהודה פלסמון פני השטח, או SPR, היא התופעה הבסיסית מאחורי biosensors מסוימים ללא תווית להערכת אינטראקציות מחייבות וספיכה של ביומולקולים. קשירת התקפות הדורשות תיוג, כגון ELISA, יכולות להיות תהליך הגוזל זמן רב ועשויות לשנות את הפונקציונליות של הניתוח. ב- SPR, אינטראקציות ביומולקולריות מתרחשות על חיישן מיוחד עשוי שכבה דקה של מתכת על פנים אחד של פריזמה. על ידי ניטור השינויים באור המשתקפים מהיד תחתון המתכת, מכשירי SPR מדמים אינטראקציות אלה בזמן אמת ללא שימוש בתוויות. וידאו זה יציג את העקרונות של SPR, הליך כללי עבור הדמיית SPR, וכמה יישומים של ביוכימיה.

חיישן SPR עשוי בדרך כלל משכבה דקה של מתכת אצילית על פני מנסרה. כדי לקחת קריאות מהחיישן, האור משתקף מממשק פריזמה-מתכת לתוך פוטו-דקטור. האור המוחזר יהיה בעוצמה גבוהה למעט בזווית מסוימת, הקשורים למאפיינים האלקטרוניים של משטח המתכת, המכונה "זווית התהודה של פלסמון פני השטח".

כאשר מולקולות נקשרות לפני השטח, המאפיינים האלקטרוניים של המתכת משתנים, אשר בתורו מתאים את הזווית. ככל שחלבונים חדשים מתחברים ויוצרים קומפלקסים, הזווית תזוז עוד יותר. על-ידי מדידת שינויים יחסיים בזווית ה-SPR, ניתן לנטר אינטראקציות כאלה בזמן אמת.

טכניקה נוספת הנקראת לוקליזציה, או "L"SPR, משתמשת בננו-חלקיקי מתכת כמשטח החיישן. המאפיינים המשפיעים על זווית SPR הם מקומיים מאוד לכל ננו-חלקיק, אשר משפר את הרגישות ואת רזולוציית האות.

בעת חקירת אינטראקציות מחייבות עם SPR סטנדרטי, החיישן מותקן בדרך כלל בפלטפורמה שהופכת לרצפה של תא זרימה במכשיר. הביומולקולים של עניין נישאים דרך תא הזרימה על ידי פתרון חוצץ. משטח החיישן מצופה לעתים קרובות תחילה במצע בעל זיקה גבוהה למתכת. זה מבטיח כי כמות משמעותית של ליגנד, אשר בתורו נקשר לניתוח של עניין, יהיה משותק על החיישן ומפחית את הסבירות כי ליגנד יהיה להתנתק במהלך ההליך.

ברגע שהליגנד משותק בחיישן, הניתוח זורם מעל החיישן במאגר. על-ידי ניטור השינוי בזווית ה- SPR לאורך זמן כאשר הניתוח נקשר לליגנד, ניתן לחשב את קצב האיגוד ומידע קינטי אחר.

נתוני רפלקטיביות יכולים לשמש גם עבור הדמיית SPR, או SPRi, על ידי הפניית האור המוחזר לגלאי CCD. פעולה זו מפיקה תמונה ברזולוציה גבוהה עם ניגודיות גבוהה של כל משטח החיישן. באמצעות SPR והטכניקות הקשורות, ניתן לענות על שאלות על זיקה מולקולרית, קינטיקה, ספציפיות וריכוז.

עכשיו שאתם מבינים מה נמדד בניסוי SPR, בואו נסתכל על הליך לחקירת שיעורי כריכה.

לפני תחילת ההליך, יש להכין את המאגרים הפועלים והדוגמאים. המאגר פועל משמש להפקדת הליבנד על החיישן, ואת המאגר לדוגמה משמש להפקדת הניתוח. שבב החיישן מנוקה בקפידה ונטען לתוך נדן. לאחר מכן, ההתקן ממוקם לתוך המכשיר, שם הוא הופך לתחתית תא הזרימה. תוכנת המכשיר מוגדרת לניסוי ולניתוח שלאחר מכן. במידת הצורך, משטח החיישן מוכן עם מצע כדי ללכוד את הליגנד. הליגנד זורם על פני השטח של החיישן במאגר הריצה, שם הוא נלכד על ידי המצע על פני השטח של החיישן.

לאחר מכן, הניתוח במאגר המדגם עובר דרך תא הזרימה, שם הוא נקשר באופן סלקטיבי לליגנד משותק. השינוי בשיקוף משורטט ומושווה כנגד פקדים כדי לקבוע קבועי קצב ונתונים קינטיים תגובה אחרים עבור התגובה הנחקרת.

עכשיו שאתם מבינים איך ניסוי SPR מבוצע, בואו נסתכל על כמה יישומים אחרים של SPR בביוכימיה.

כאן, דימות SPR שימש להערכת חלבונים עם מערך של 11 קולטנים על חיישן. גרפים תלת-ממדיים של רפלקטיביות לעומת זמן וריכוז הקולטן הוכנו מנתוני הרפלקטיביות עבור כל חלבון. "פרופילים" אלה אופייניים לכל חלבון, ולכן יכול לשמש לאחר מכן לזיהוי חלבון.

בניסוי זה, הפרשות תאים נחקרו באמצעות חיישן LSPR בהתאמה אישית. החיישן היה תואם גם למיקרוסקופיה SPRi ופלואורסצנטית. עם הפקדת התא על החיישן, האינטראקציה של הפרשות התא עם מערך הננו-חלקיקים יכולה להימדד ברזולוציה מרחבית גבוהה.

כאן, השימוש בנקודות קוונטיות, מוליכים למחצה ננומטריים, כסוכן שיפור אותות SPR מעורבב עם הניתוח נחקר. שיטת "ננו-SPRi" משופרת זו הושוותה לבדיקות על ידי SPRi סטנדרטי ושיטת ELISA. שיטת nano-SPRi שיפרה באופן משמעותי את הרגישות ואת גבול הזיהוי תוך שהיא עדיין גוזלת פחות זמן משיטת ELISA.

הרגע צפית בסרטון של ג'וב על תהודה על פני השטח. תופעה זו משמשת לניטור ותמונה אינטראקציות ביומולקולריות ללא שימוש בתוויות. וידאו זה הציג את העקרונות של SPR, פרוטוקול טיפוסי לביצוע ניסוי SPR, וכמה יישומים של SPR בביוכימיה.

תודה שצפיתם!

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תהודה פלסמון פני השטח (SPR) היא התופעה האופטית הבסיסית מאחורי biosensors ללא תוויות כדי להעריך את הזיקה המולקולרית, הקינטיקה, הספציפיות, וריכוז של biomolecules. ב- SPR, אינטראקציות ביומולקולריות מתרחשות על biosensor עשוי שכבה דקה של מתכת על פריזמה. אינטראקציות בזמן אמת של biomolecules ניתן לפקח על ידי מדידת השינויים של אור משתקף את החלק התחתון של המתכת.

וידאו זה מתאר את המושגים הבסיסיים של SPR וכיצד הוא משמש לניתוח והדמיה של אינטראקציות ביומולקולריות. לאחר מכן הכנה מדגם ופרוטוקול ניסיוני לחקירת שיעורי כריכה באמצעות SPR. בסעיף היישומים, הדמיית SPR, SPR מקומי ו- SPR משופר נקודה קוונטית נחקרים.

תהודה פלסמון פני השטח, או SPR, היא התופעה הבסיסית מאחורי biosensors מסוימים ללא תווית להערכת אינטראקציות מחייבות וספיכה של ביומולקולים. קשירת התקפות הדורשות תיוג, כגון ELISA, יכולות להיות תהליך הגוזל זמן רב ועשויות לשנות את הפונקציונליות של הניתוח. ב- SPR, אינטראקציות ביומולקולריות מתרחשות על חיישן מיוחד עשוי שכבה דקה של מתכת על פנים אחד של פריזמה. על ידי ניטור השינויים באור המשתקפים מהיד תחתון המתכת, מכשירי SPR מדמים אינטראקציות אלה בזמן אמת ללא שימוש בתוויות. וידאו זה יציג את העקרונות של SPR, הליך כללי עבור הדמיית SPR, וכמה יישומים של ביוכימיה.

חיישן SPR עשוי בדרך כלל משכבה דקה של מתכת אצילית על פני מנסרה. כדי לקחת קריאות מהחיישן, האור משתקף מממשק פריזמה-מתכת לתוך פוטו-דקטור. האור המוחזר יהיה בעוצמה גבוהה למעט בזווית מסוימת, הקשורים למאפיינים האלקטרוניים של משטח המתכת, המכונה "זווית התהודה של פלסמון פני השטח".

כאשר מולקולות נקשרות לפני השטח, המאפיינים האלקטרוניים של המתכת משתנים, אשר בתורו מתאים את הזווית. ככל שחלבונים חדשים מתחברים ויוצרים קומפלקסים, הזווית תזוז עוד יותר. על-ידי מדידת שינויים יחסיים בזווית ה-SPR, ניתן לנטר אינטראקציות כאלה בזמן אמת.

טכניקה נוספת הנקראת לוקליזציה, או "L"SPR, משתמשת בננו-חלקיקי מתכת כמשטח החיישן. המאפיינים המשפיעים על זווית SPR הם מקומיים מאוד לכל ננו-חלקיק, אשר משפר את הרגישות ואת רזולוציית האות.

בעת חקירת אינטראקציות מחייבות עם SPR סטנדרטי, החיישן מותקן בדרך כלל בפלטפורמה שהופכת לרצפה של תא זרימה במכשיר. הביומולקולים של עניין נישאים דרך תא הזרימה על ידי פתרון חוצץ. משטח החיישן מצופה לעתים קרובות תחילה במצע בעל זיקה גבוהה למתכת. זה מבטיח כי כמות משמעותית של ליגנד, אשר בתורו נקשר לניתוח של עניין, יהיה משותק על החיישן ומפחית את הסבירות כי ליגנד יהיה להתנתק במהלך ההליך.

ברגע שהליגנד משותק בחיישן, הניתוח זורם מעל החיישן במאגר. על-ידי ניטור השינוי בזווית ה- SPR לאורך זמן כאשר הניתוח נקשר לליגנד, ניתן לחשב את קצב האיגוד ומידע קינטי אחר.

נתוני רפלקטיביות יכולים לשמש גם עבור הדמיית SPR, או SPRi, על ידי הפניית האור המוחזר לגלאי CCD. פעולה זו מפיקה תמונה ברזולוציה גבוהה עם ניגודיות גבוהה של כל משטח החיישן. באמצעות SPR והטכניקות הקשורות, ניתן לענות על שאלות על זיקה מולקולרית, קינטיקה, ספציפיות וריכוז.

עכשיו שאתם מבינים מה נמדד בניסוי SPR, בואו נסתכל על הליך לחקירת שיעורי כריכה.

לפני תחילת ההליך, יש להכין את המאגרים הפועלים והדוגמאים. המאגר פועל משמש להפקדת הליבנד על החיישן, ואת המאגר לדוגמה משמש להפקדת הניתוח. שבב החיישן מנוקה בקפידה ונטען לתוך נדן. לאחר מכן, ההתקן ממוקם לתוך המכשיר, שם הוא הופך לתחתית תא הזרימה. תוכנת המכשיר מוגדרת לניסוי ולניתוח שלאחר מכן. במידת הצורך, משטח החיישן מוכן עם מצע כדי ללכוד את הליגנד. הליגנד זורם על פני השטח של החיישן במאגר הריצה, שם הוא נלכד על ידי המצע על פני השטח של החיישן.

לאחר מכן, הניתוח במאגר המדגם עובר דרך תא הזרימה, שם הוא נקשר באופן סלקטיבי לליגנד משותק. השינוי בשיקוף משורטט ומושווה כנגד פקדים כדי לקבוע קבועי קצב ונתונים קינטיים תגובה אחרים עבור התגובה הנחקרת.

עכשיו שאתם מבינים איך ניסוי SPR מבוצע, בואו נסתכל על כמה יישומים אחרים של SPR בביוכימיה.

כאן, דימות SPR שימש להערכת חלבונים עם מערך של 11 קולטנים על חיישן. גרפים תלת-ממדיים של רפלקטיביות לעומת זמן וריכוז הקולטן הוכנו מנתוני הרפלקטיביות עבור כל חלבון. "פרופילים" אלה אופייניים לכל חלבון, ולכן יכול לשמש לאחר מכן לזיהוי חלבון.

בניסוי זה, הפרשות תאים נחקרו באמצעות חיישן LSPR בהתאמה אישית. החיישן היה תואם גם למיקרוסקופיה SPRi ופלואורסצנטית. עם הפקדת התא על החיישן, האינטראקציה של הפרשות התא עם מערך הננו-חלקיקים יכולה להימדד ברזולוציה מרחבית גבוהה.

כאן, השימוש בנקודות קוונטיות, מוליכים למחצה ננומטריים, כסוכן שיפור אותות SPR מעורבב עם הניתוח נחקר. שיטת "ננו-SPRi" משופרת זו הושוותה לבדיקות על ידי SPRi סטנדרטי ושיטת ELISA. שיטת nano-SPRi שיפרה באופן משמעותי את הרגישות ואת גבול הזיהוי תוך שהיא עדיין גוזלת פחות זמן משיטת ELISA.

הרגע צפית בסרטון של ג'וב על תהודה על פני השטח. תופעה זו משמשת לניטור ותמונה אינטראקציות ביומולקולריות ללא שימוש בתוויות. וידאו זה הציג את העקרונות של SPR, פרוטוקול טיפוסי לביצוע ניסוי SPR, וכמה יישומים של SPR בביוכימיה.

תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter