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Risonanza plasmonica di superficie (SPR)
 
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Risonanza plasmonica di superficie (SPR)

Overview

La risonanza plasmonica di superficie (SPR) è il fenomeno ottico alla base dei biosensori privi di etichette per valutare l'affinità molecolare, la cinetica, la specificità e la concentrazione delle biomolecole. In SPR, le interazioni biomolecolari avvengono su un biosensore costituito da un sottile strato di metallo su un prisma. Le interazioni in tempo reale delle biomolecole possono essere monitorate misurando i cambiamenti di luce riflessa dalla parte inferiore del metallo.

Questo video descrive i concetti di base di SPR e come viene utilizzato per analizzare e visualizzare le interazioni biomolecolari. Questo è seguito da una preparazione del campione e da un protocollo sperimentale per studiare i tassi di legame utilizzando SPR. Nella sezione applicazioni vengono esplorati l'imaging SPR, l'SPR localizzato e l'SPR potenziato con punti quantici.

La risonanza plasmonica di superficie, o SPR, è il fenomeno alla base di alcuni biosensori privi di etichette per valutare le interazioni di legame e adsorbimento delle biomolecole. I saggi di associazione che richiedono l'etichettatura, come ELISA, possono essere un processo che richiede molto tempo e possono alterare la funzionalità dell'analita. In SPR, le interazioni biomolecolari avvengono su uno speciale sensore costituito da un sottile strato di metallo su una faccia di un prisma. Monitorando i cambiamenti di luce riflessi dalla parte inferiore del metallo, gli strumenti SPR visualizzano queste interazioni in tempo reale senza l'uso di etichette. Questo video introdurrà i principi di SPR, una procedura generale per l'imaging SPR e alcune applicazioni di in biochimica.

Un sensore SPR è solitamente costituito da un sottile strato di metallo nobile in cima alla faccia di un prisma. Per prendere le letture dal sensore, la luce viene riflessa dall'interfaccia prisma-metallo in un fotorivelatore. La luce riflessa avrà un'alta intensità tranne che ad un certo angolo, correlato alle proprietà elettroniche della superficie metallica, noto come "angolo di risonanza plasmonica di superficie".

Quando le molecole si legano alla superficie, le proprietà elettroniche del metallo cambiano, che a sua volta regola l'angolo. Man mano che le nuove proteine si attaccano, formando complessi, l'angolo si sposterà ulteriormente. Misurando i cambiamenti relativi nell'angolo SPR, interazioni come queste possono essere monitorate in tempo reale.

Un'altra tecnica chiamata localizzata, o "L"SPR, utilizza nanoparticelle metalliche come superficie del sensore. Le proprietà che influenzano l'angolo SPR sono altamente localizzate in ogni nanoparticella, il che migliora la sensibilità e la risoluzione del segnale.

Quando si studiano le interazioni di legame con SPR standard, il sensore è generalmente montato in una piattaforma che diventa il pavimento di una cella di flusso nello strumento. Le biomolecole di interesse vengono trasportate attraverso la cella di flusso mediante soluzione tampone. La superficie del sensore viene spesso prima rivestita con un substrato che ha un'alta affinità per il metallo. Ciò garantisce che una quantità significativa di ligando, che a sua volta si lega all'analita di interesse, sarà immobilizzata sul sensore e riduce la probabilità che il ligando si dissoci durante la procedura.

Una volta che il ligando è immobilizzato sul sensore, l'analita viene fatto scorrere sul sensore nel buffer. Monitorando la variazione dell'angolo SPR nel tempo mentre l'analita si lega al ligando, è possibile calcolare la velocità di legame e altre informazioni cinetiche.

I dati di riflettanza possono anche essere utilizzati per l'imaging SPR, o SPRi, dirigendo la luce riflessa verso un rilevatore CCD. Ciò produce un'immagine ad alto contrasto e ad alta risoluzione dell'intera superficie del sensore. Utilizzando SPR e le tecniche correlate, è possibile rispondere a domande sull'affinità molecolare, la cinetica, la specificità e la concentrazione.

Ora che hai capito cosa viene misurato in un esperimento SPR, diamo un'occhiata a una procedura per indagare i tassi di legame.

Prima di iniziare la procedura, è necessario preparare i buffer in esecuzione e di esempio. Il buffer in esecuzione viene utilizzato per depositare il ligando sul sensore e il buffer del campione viene utilizzato per depositare l'analita. Il chip del sensore viene accuratamente pulito e caricato in una guaiina. Quindi, il dispositivo viene inserito nello strumento, dove diventa il fondo della cella di flusso. Il software dello strumento è impostato per l'esperimento e la successiva analisi. Se necessario, la superficie del sensore viene innescata con un substrato per catturare il ligando. Il ligando viene fatto scorrere sulla superficie del sensore nel buffer di corsa, dove viene catturato dal substrato sulla superficie del sensore.

Quindi, l'analita nel buffer del campione viene fatto scorrere attraverso la cella di flusso, dove si lega selettivamente al ligando immobilizzato. Il cambiamento nella riflettanza viene tracciato e confrontato con i controlli per determinare le costanti di velocità e altri dati di cinetica di reazione per la reazione studiata.

Ora che hai capito come viene eseguito un esperimento SPR, diamo un'occhiata ad alcune altre applicazioni di SPR in biochimica.

Qui, l'imaging SPR è stato utilizzato per valutare le proteine con una serie di undici recettori su un sensore. I grafici 3D della riflettività rispetto al tempo e alla concentrazione del recettore sono stati preparati dai dati di riflettività per ciascuna proteina. Questi "profili" sono caratteristici di ogni proteina e quindi potrebbero essere successivamente utilizzati per l'identificazione delle proteine.

In questo esperimento, le secrezioni cellulari sono state studiate utilizzando un sensore LSPR su misura. Il sensore era anche compatibile con SPRi e microscopia a fluorescenza. Dopo aver depositato la cellula sul sensore, l'interazione delle secrezioni cellulari con l'array di nanoparticelle potrebbe essere misurata con un'alta risoluzione spaziale.

Qui è stato studiato l'uso di punti quantici, semiconduttori su scala nanometrica, come agente di miglioramento del segnale SPR mescolato con l'analita. Questo metodo avanzato "nano-SPRi" è stato confrontato con i saggi con SPRi standard e il metodo ELISA. Il metodo nano-SPRi ha migliorato significativamente la sensibilità e il limite di rilevamento, pur essendo meno dispendioso in termini di tempo rispetto al metodo ELISA.

Hai appena visto il video di JoVE sulla risonanza plasmonica di superficie. Questo fenomeno viene utilizzato per monitorare e immaginare le interazioni biomolecolari senza l'uso di etichette. Questo video ha introdotto i principi di SPR, un protocollo tipico per l'esecuzione di un esperimento SPR, e alcune applicazioni di SPR in biochimica.

Grazie per l'attenzione!

Procedure

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La risonanza plasmonica di superficie (SPR) è il fenomeno ottico alla base dei biosensori privi di etichette per valutare l'affinità molecolare, la cinetica, la specificità e la concentrazione delle biomolecole. In SPR, le interazioni biomolecolari avvengono su un biosensore costituito da un sottile strato di metallo su un prisma. Le interazioni in tempo reale delle biomolecole possono essere monitorate misurando i cambiamenti di luce riflessa dalla parte inferiore del metallo.

Questo video descrive i concetti di base di SPR e come viene utilizzato per analizzare e visualizzare le interazioni biomolecolari. Questo è seguito da una preparazione del campione e da un protocollo sperimentale per studiare i tassi di legame utilizzando SPR. Nella sezione applicazioni vengono esplorati l'imaging SPR, l'SPR localizzato e l'SPR potenziato con punti quantici.

La risonanza plasmonica di superficie, o SPR, è il fenomeno alla base di alcuni biosensori privi di etichette per valutare le interazioni di legame e adsorbimento delle biomolecole. I saggi di associazione che richiedono l'etichettatura, come ELISA, possono essere un processo che richiede molto tempo e possono alterare la funzionalità dell'analita. In SPR, le interazioni biomolecolari avvengono su uno speciale sensore costituito da un sottile strato di metallo su una faccia di un prisma. Monitorando i cambiamenti di luce riflessi dalla parte inferiore del metallo, gli strumenti SPR visualizzano queste interazioni in tempo reale senza l'uso di etichette. Questo video introdurrà i principi di SPR, una procedura generale per l'imaging SPR e alcune applicazioni di in biochimica.

Un sensore SPR è solitamente costituito da un sottile strato di metallo nobile in cima alla faccia di un prisma. Per prendere le letture dal sensore, la luce viene riflessa dall'interfaccia prisma-metallo in un fotorivelatore. La luce riflessa avrà un'alta intensità tranne che ad un certo angolo, correlato alle proprietà elettroniche della superficie metallica, noto come "angolo di risonanza plasmonica di superficie".

Quando le molecole si legano alla superficie, le proprietà elettroniche del metallo cambiano, che a sua volta regola l'angolo. Man mano che le nuove proteine si attaccano, formando complessi, l'angolo si sposterà ulteriormente. Misurando i cambiamenti relativi nell'angolo SPR, interazioni come queste possono essere monitorate in tempo reale.

Un'altra tecnica chiamata localizzata, o "L"SPR, utilizza nanoparticelle metalliche come superficie del sensore. Le proprietà che influenzano l'angolo SPR sono altamente localizzate in ogni nanoparticella, il che migliora la sensibilità e la risoluzione del segnale.

Quando si studiano le interazioni di legame con SPR standard, il sensore è generalmente montato in una piattaforma che diventa il pavimento di una cella di flusso nello strumento. Le biomolecole di interesse vengono trasportate attraverso la cella di flusso mediante soluzione tampone. La superficie del sensore viene spesso prima rivestita con un substrato che ha un'alta affinità per il metallo. Ciò garantisce che una quantità significativa di ligando, che a sua volta si lega all'analita di interesse, sarà immobilizzata sul sensore e riduce la probabilità che il ligando si dissoci durante la procedura.

Una volta che il ligando è immobilizzato sul sensore, l'analita viene fatto scorrere sul sensore nel buffer. Monitorando la variazione dell'angolo SPR nel tempo mentre l'analita si lega al ligando, è possibile calcolare la velocità di legame e altre informazioni cinetiche.

I dati di riflettanza possono anche essere utilizzati per l'imaging SPR, o SPRi, dirigendo la luce riflessa verso un rilevatore CCD. Ciò produce un'immagine ad alto contrasto e ad alta risoluzione dell'intera superficie del sensore. Utilizzando SPR e le tecniche correlate, è possibile rispondere a domande sull'affinità molecolare, la cinetica, la specificità e la concentrazione.

Ora che hai capito cosa viene misurato in un esperimento SPR, diamo un'occhiata a una procedura per indagare i tassi di legame.

Prima di iniziare la procedura, è necessario preparare i buffer in esecuzione e di esempio. Il buffer in esecuzione viene utilizzato per depositare il ligando sul sensore e il buffer del campione viene utilizzato per depositare l'analita. Il chip del sensore viene accuratamente pulito e caricato in una guaiina. Quindi, il dispositivo viene inserito nello strumento, dove diventa il fondo della cella di flusso. Il software dello strumento è impostato per l'esperimento e la successiva analisi. Se necessario, la superficie del sensore viene innescata con un substrato per catturare il ligando. Il ligando viene fatto scorrere sulla superficie del sensore nel buffer di corsa, dove viene catturato dal substrato sulla superficie del sensore.

Quindi, l'analita nel buffer del campione viene fatto scorrere attraverso la cella di flusso, dove si lega selettivamente al ligando immobilizzato. Il cambiamento nella riflettanza viene tracciato e confrontato con i controlli per determinare le costanti di velocità e altri dati di cinetica di reazione per la reazione studiata.

Ora che hai capito come viene eseguito un esperimento SPR, diamo un'occhiata ad alcune altre applicazioni di SPR in biochimica.

Qui, l'imaging SPR è stato utilizzato per valutare le proteine con una serie di undici recettori su un sensore. I grafici 3D della riflettività rispetto al tempo e alla concentrazione del recettore sono stati preparati dai dati di riflettività per ciascuna proteina. Questi "profili" sono caratteristici di ogni proteina e quindi potrebbero essere successivamente utilizzati per l'identificazione delle proteine.

In questo esperimento, le secrezioni cellulari sono state studiate utilizzando un sensore LSPR su misura. Il sensore era anche compatibile con SPRi e microscopia a fluorescenza. Dopo aver depositato la cellula sul sensore, l'interazione delle secrezioni cellulari con l'array di nanoparticelle potrebbe essere misurata con un'alta risoluzione spaziale.

Qui è stato studiato l'uso di punti quantici, semiconduttori su scala nanometrica, come agente di miglioramento del segnale SPR mescolato con l'analita. Questo metodo avanzato "nano-SPRi" è stato confrontato con i saggi con SPRi standard e il metodo ELISA. Il metodo nano-SPRi ha migliorato significativamente la sensibilità e il limite di rilevamento, pur essendo meno dispendioso in termini di tempo rispetto al metodo ELISA.

Hai appena visto il video di JoVE sulla risonanza plasmonica di superficie. Questo fenomeno viene utilizzato per monitorare e immaginare le interazioni biomolecolari senza l'uso di etichette. Questo video ha introdotto i principi di SPR, un protocollo tipico per l'esecuzione di un esperimento SPR, e alcune applicazioni di SPR in biochimica.

Grazie per l'attenzione!

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Transcript

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