Conductas instintivas de defensa en gran parte se consideran ser hardwired estímulo-respuesta, como el movimiento de arranque C en peces y anfibios, que se mueve el animal lejos de una fuente de amenaza1. Sin embargo, conductas defensivas pueden ser más adaptativos si flexibilidad toman en cuenta la información aprendida sobre el entorno actual. Un ejemplo de esta flexibilidad es el cambio de escape a congelación se muestra por los roedores cuando amenaza, dependiendo del conocimiento previo sobre la presencia o ausencia de un refugio en el medio ambiente2,3. Otros ejemplos de flexibilidad en los comportamientos naturales incluyen la adaptación del umbral de iniciación de vuelo o escapan de velocidad dependiendo de la distancia entre una presa y su refugio4, distancia amenaza5,6y anterior experiencia 11 , 12, así como seleccionar diferentes estrategias defensivas dependiendo de las propiedades sensoriales del estímulo aversivo7, o incluso suprimir el comportamiento defensivo frente a competidores motivaciones tales como hambre8, 9,10. La dependencia de selección de acción en el conocimiento adquirido acerca de las características espaciales del medio ambiente hace conductas instintivas de defensa en ratones un poderoso modelo para el estudio de selección de objetivo, memoria espacial y la navegación. Aquí, describimos la adaptación de una tarea conductual utilizada, análisis de la memoria espacial del laberinto (BM) Barnes13, para determinar la influencia del ambiente espacial en la selección de la acción defensiva en los ratones y sus estrategias de navegación cuando escapar hacia un refugio.
El laberinto de Barnes estándar utilizado para estudiar el aprendizaje memoria espacial en ratones consiste en una plataforma de diámetro circular ~ 90 cm con 20 orificios equidistantes, de las cuales 19 están cerrados y uno conduce a un refugio subterráneo que ratones buscan evitar el campo abierto para entorno de la plataforma. Débiles estímulos aversivos (timbre, luz, ventilador) se utilizan a menudo, continuamente a lo largo del ensayo para hacer el entorno aversivo y así promover la entrada en el refugio14. En el ensayo más utilizado15,16, el animal tiene un ensayo de habituación donde es guiado hasta el refugio manualmente por el experimentador inmediatamente después de ser colocado en la plataforma. Esto es seguido por un período de 4 días de adquisición, donde cada día que el ratón puedo navegar libremente en el laberinto durante 3 min, después de que es otra vez manualmente guiado al refugio si no alcanza durante el período de exploración. La última etapa del análisis es una sonda de prueba en la 5º jornada (aunque también comúnmente se realiza una memoria a largo plazo de siete días prueba) cuando el animal explora el laberinto con todos los orificios cerrados. Memoria aprendizaje y a largo plazo se cuantifican por el tiempo necesario para encontrar el refugio y pinchazos en los agujeros equivocados durante el período de adquisición y por el tiempo cerca del agujero cerrado refugio en la prueba de la sonda. Resultados típicos muestran una disminución en el número de errores y la latencia para alcanzar el refugio durante la adquisición y una proporción por encima de la posibilidad de tiempo en el cuadrante que contiene el orificio cerrado blanco en la punta de prueba prueba15.
Mientras que varias variantes del ensayo BM han sido previamente descritos17,18,19, el paradigma que Describimos aquí tiene tres cambios fundamentales desde el ensayo estándar. En primer lugar, el animal quedo por explorar el laberinto y encontrar el refugio en su propia, y la prueba es hecha en la misma sesión, poco después de que se ha encontrado el refugio durante los períodos donde el animal se dedica a la conducta exploratoria. Aunque esta opción no comprueba memoria a largo plazo de la situación de refugio, se diseña un escenario naturalista que imita a la exploración del nuevo territorio, bajo la amenaza de depredación. Además, permite realizar pruebas de cómo los animales se adaptan a los cambios agudos en el entorno, como cambios bruscos de paisaje. En segundo lugar, un aspecto clave de nuestro análisis es que el experimentador no fuerzas el animal dentro o fuera de la vivienda, que puede desorientar al animal y excluir la ruta de integración20 como una estrategia viable de la navegación del21. Camino de la integración es una estrategia de navegación que utiliza señales de uno mismo-movimiento, tales como señales propioceptivas y vestibulares, derivados de la integración del motor de la salida, para actualizar la posición actual del animal y navegar hacia una meta, que no es posible si el animal se mueve pasivamente por el experimentador. En tercer lugar, utilizamos visual innata aversión22 y estímulos auditivos23 para escapar a la vivienda, que se distingue fácilmente del comportamiento de alimentación continua y permite la evaluación y cuantificación de estrategias específicas de navegación durante la defensa de las amenazas inminentes. Proponemos que este análisis será útil para diseccionar el papel de la memoria espacial en la selección y aplicación de conductas defensivas, y más generalmente en el más amplio estudian de meta-dirigida de la navegación y la memoria espacial a corto plazo. Los protocolos descritos aquí fueron introducidos por Vale et al. en 2017, a que nos referimos a los lectores más en discusión de la profundidad de los fundamentos para los experimentos y resultados.
Este ensayo puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la memoria espacial, como la forma en que los animales navegan hacia una ubicación objetivo recientemente aprendida. La principal ventaja de este paradigma es que provoca un comportamiento de navegación dirigido a un objetivo etiológicamente importante que se desencadena por un estímulo sensorial bien controlado, y no requiere entrenamiento previo de los ratones. Comience colocando señales visuales en la periferia de la plataforma, que debe estar al menos a dos centímetros del borde para evitar que los ratones las alcancen.
Fije el refugio a la plataforma. Luego, coloque un diodo emisor de luz, o LED, en la entrada del refugio para proporcionar una señal de referencia visual local. A continuación, para aislar al ratón de las señales visuales distales externas, ensamble una pared octogonal que se extienda 40 centímetros por encima y 15 centímetros por debajo de la superficie de la plataforma alrededor de la arena, colocada a 10 centímetros del borde de la plataforma.
Coloque un altavoz de ultrasonido a 50 centímetros por encima del centro de la plataforma para emitir estímulos auditivos aversivos y conecte una tarjeta de sonido y un amplificador a un altavoz. Luego, coloque una pantalla translúcida a 64 centímetros por encima de la arena para proyectar estímulos visuales aversivos desde arriba con un proyector. Calibre la luz del proyector de modo que haya de cinco a 10 orejetas en el centro de la superficie de la plataforma.
Coloque luces infrarrojas y una cámara infrarroja con un filtro de paso de pérdida sobre la plataforma para evitar el parpadeo del protector en el video adquirido. Luego, coloque el aparato conductual dentro de una caja a prueba de luz y sonido para evitar que las señales externas afecten el experimento. Por último, utilice el software disponible en el mercado para rastrear la posición del ratón en línea.
Comienza proyectando los estímulos visuales en la pantalla colocada sobre la arena. Rastree la posición del ratón en línea y predefina una región de interés en la arena correspondiente a la ubicación del estímulo visual previamente definido para centrar el estímulo visual por encima del animal. A continuación, pruebe el estímulo auditivo que consiste en un tren de tres barridos ascendentes de frecuencia modulada de 17 a 20 kilohercios durante tres segundos que duran nueve segundos en total.
Comience limpiando meticulosamente la superficie de la plataforma con etanol al 70% para eliminar las señales olfativas no deseadas. Enjuague el refugio con agua y etanol al 70%, luego lave una vez más con agua para eliminar el olor a etanol. Seque bien tanto la plataforma como el refugio, ya que el ratón puede evitar entrar en el refugio si está mojado.
Varía la ubicación del refugio en la plataforma para cada prueba girando la plataforma antes del experimento. A continuación, lleve el ratón a la sala de experimentos en su jaula de origen y coloque la jaula al lado de la plataforma de prueba durante un período de aclimatación de 10 minutos. Agregue dos gramos de ropa de cama de la jaula de la casa del ratón al interior del refugio para que sirva como una señal olfativa local.
Saca al ratón de su jaula y evita que lo recupere por la cola. Tócalo con una taza o déjalo trepar sobre un elemento de enriquecimiento que se pueda levantar. Luego, coloque suavemente el mouse en el centro de la arena e inicie la adquisición de video.
Permita un período de habituación de siete minutos, durante el cual no se presente ningún estímulo aversivo. Asegúrese de que el ratón tenga tiempo suficiente para encontrar y entrar al refugio al menos una vez, que es cuando las cuatro extremidades están dentro del refugio. A continuación, activa automática o manualmente la entrega del estímulo visual centrado sobre el ratón una vez que el animal alcanza una región de interés predefinida.
Para provocar más de una respuesta de escape en la misma sesión, permita que el ratón abandone voluntariamente el refugio. Una vez finalizado el ensayo, regrese al animal a su jaula de origen. Por último, limpie la plataforma y el refugio antes de probar al siguiente animal.
Los ratones expuestos a estímulos auditivos o visuales iniciaron respuestas de escape rápidas con latencias cortas entre el inicio de la estimulación y el inicio del vuelo. La latencia media para escapar del estímulo fue significativamente mayor para la estimulación auditiva que para la visual. Además, la navegación al refugio era precisa y las trayectorias de vuelo eran casi una línea recta en todos los tipos de estímulos.
Después de un período de aclimatación de siete minutos al laberinto sin refugio, la presentación de un estímulo visual prolongado produjo un comportamiento de congelación en lugar de escape. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 90 minutos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar presentar el estímulo visual por encima o por encima en la cabeza del ratón, y no mientras el ratón está investigando el borde de la plataforma, ya que probablemente pasará por alto el estímulo.
Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del comportamiento instintivo exploraran el control del conocimiento aprendido sobre el comportamiento defensivo instintivo en ratones. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo provocar un comportamiento defensivo en ratones y cómo usarlos para estudiar la navegación espacial durante las respuestas de escape.