Comportamenti difensivi istintivi in gran parte sono considerati essere hardwired risposte agli stimoli, ad esempio il movimento di C-start in pesci e anfibi, che sposta l'animale lontano da una fonte di minaccia1. Tuttavia, i comportamenti difensivi possono essere più adattabili se flessibilmente tengono conto delle informazioni apprese sull'ambiente corrente. Un esempio di tale flessibilità è il passaggio da fuga a congelamento mostrato dai roditori quando di fronte alla minaccia, a seconda della conoscenza circa la presenza o l'assenza di un ricovero in ambiente2,3. Altri esempi di flessibilità nei comportamenti innati includono adattando la soglia di iniziazione di volo o sfuggire la velocità a seconda della distanza tra una preda e suo riparo4, distanza a minaccia5,6e precedente esperienza 11 , 12, anche selezionando diverse strategie difensive a seconda delle proprietà sensoriali del stimolo avversivo7, o anche soppressione comportamento difensivo di fronte concorrenti motivazioni quali la fame8, 9,10. La dipendenza della selezione di azione su conoscenze acquisite circa le caratteristiche spaziali dell'ambiente rende istintivi comportamenti difensivi nei topi un potente modello per lo studio della selezione obiettivo, la memoria spaziale e la navigazione. Qui, descriviamo l'adattamento di un'attività comportamento comunemente usata, la memoria spaziale del labirinto (BM) Barnes del kit13, per determinare l'influenza dell'ambiente spaziale sulla selezione azione difensiva nei topi e le loro strategie di navigazione quando in fuga verso un riparo.
Il labirinto di Barnes standard usato per studiare la memoria spaziale e apprendimento nei topi è costituito da una piattaforma di diametro circolare ~ 90 cm con 20 fori equidistanti, di cui 19 sono chiuse, e uno conduce ad un rifugio sotterraneo che topi si adoperi al fine di evitare il campo aperto ambiente della piattaforma. Spesso, deboli stimoli avversivi (cicalino, luce, ventilatore) vengono utilizzati continuamente durante tutto il test per rendere l'ambiente che ha avversione e promuovere così entrata nel rifugio14. Nel dosaggio più comunemente usato15,16, l'animale ha una prova di assuefazione dove è guidato al riparo manualmente dallo sperimentatore immediatamente dopo essendo posizionato sulla piattaforma. Questo è seguito da un periodo di 4 giorni acquisizione, dove ogni giorno che il mouse è permesso di navigare liberamente nel labirinto per 3 min, dopo di che viene nuovamente manualmente guidato al riparo se non si raggiunge durante il periodo di esplorazione. L'ultima tappa del dosaggio è una sonda di prova sul 5° giorno (anche se una memoria a lungo termine di sette giorni trial è anche comunemente eseguita) quando l'animale Esplora il labirinto con tutti i fori chiusi. Memoria a lungo termine e apprendimento sono quantificati dal tempo necessario per trovare riparo e pokes nei fori sbagliati durante il periodo di acquisizione e con il tempo trascorso vicino al foro chiuso riparo la prova della sonda. I risultati tipici mostrano una diminuzione del numero di errori e latenza a raggiungere il rifugio durante l'acquisizione e una proporzione sopra possibilità di tempo trascorso nel quadrante contenente il buco bersaglio chiuso nella sonda prova15.
Mentre parecchie varianti del dosaggio BM sono stati descritti in precedenza17,18,19, il paradigma che descriviamo qui ha tre cambiamenti fondamentali del dosaggio standard. In primo luogo, l'animale viene lasciato per esplorare il labirinto e trovare rifugio in proprio, e test avviene nella stessa sessione, poco dopo il ricovero è stato trovato, durante i periodi in cui l'animale è impegnata nel comportamento esplorativo. Anche se questa impostazione non prova la memoria a lungo termine della posizione riparo, esso è progettato per essere uno scenario naturalistico che imita l'esplorazione del territorio romanzo, sotto la minaccia di predazione. Inoltre, permette testing di come gli animali si adattano ai cambiamenti acuti nell'ambiente, quali cambiamenti improvvisi nel paesaggio. In secondo luogo, un aspetto fondamentale della nostra analisi è che lo sperimentatore non impone mai l'animale dentro o fuori il rifugio, che può disorientare l'animale ed Escludi percorso integrazione20 come una navigazione valida strategia21. Integrazione dei cammini è una strategia di navigazione che utilizza segnali auto-moto, ad esempio spunti propriocettivi e vestibolari, derivanti dall'integrazione del motore deflusso, per aggiornare la posizione corrente dell'animale e navigare verso un obiettivo, che non è possibile se il animale è passivamente trasferito dallo sperimentatore. In terzo luogo, usiamo visual congenitalmente avversivi22 e stimoli uditivi23 per suscitare fuga al rifugio, che è facilmente distinguibile dal comportamento di foraggiamento in corso e consente la valutazione e quantificazione delle strategie di navigazione specifici utilizzati durante la difesa da minacce imminenti. Proponiamo che questo test può essere utile per il ruolo della memoria spaziale nella selezione e implementazione dei comportamenti difensivi di dissezione, e più in generale per il più ampio studio di navigazione mirati e memoria spaziale a breve termine. I protocolli descritti qui sono stati introdotti da Vale et al. nel 2017, a cui rimandiamo i lettori per di più in discussione in profondità delle motivazioni per esperimenti e risultati.
Questo test può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della memoria spaziale, come ad esempio il modo in cui gli animali navigano verso una posizione di obiettivo appresa di recente. Il vantaggio principale di questo paradigma è che suscita un comportamento di navigazione diretto verso l'obiettivo eziologicamente importante che viene attivato da uno stimolo sensoriale ben controllato e non richiede un addestramento preliminare dei topi. Inizia attaccando segnali visivi alla periferia della piattaforma, che dovrebbe essere ad almeno due centimetri di distanza dal bordo per evitare che i topi li raggiungano.
Fissare il riparo alla piattaforma. Quindi, posiziona un diodo a emissione luminosa, o LED, all'ingresso del rifugio per fornire un segnale visivo locale. Successivamente, per isolare il topo dai segnali visivi distali esterni, assemblare una parete ottagonale che si estende 40 centimetri sopra e 15 centimetri sotto la superficie della piattaforma attorno all'arena, posizionata a 10 centimetri di distanza dal bordo della piattaforma.
Posiziona un altoparlante a ultrasuoni a 50 centimetri sopra il centro della piattaforma per fornire stimoli uditivi avversi e collega una scheda audio e un amplificatore a un altoparlante. Quindi, posiziona uno schermo traslucido a 64 centimetri sopra l'arena per proiettare all'indietro gli stimoli visivi avversi dall'alto utilizzando un proiettore. Calibrare la luce del proiettore in modo che ci siano da cinque a 10 alette al centro della superficie della piattaforma.
Posizionare le luci a infrarossi e una telecamera a infrarossi con un filtro di perdita sopra la piattaforma per evitare lo sfarfallio della protezione nel video acquisito. Quindi, posiziona l'apparato comportamentale all'interno di una scatola a prova di suono e luce per evitare che segnali esterni influenzino l'esperimento. Infine, utilizza un software disponibile in commercio per tracciare la posizione del mouse online.
Inizia proiettando gli stimoli visivi sullo schermo posizionato sopra l'arena. Traccia la posizione del mouse online e predefinisci una regione di interesse nell'arena corrispondente alla posizione dello stimolo visivo precedentemente definito per centrare lo stimolo visivo sopra l'animale. Successivamente, testare lo stimolo uditivo costituito da un treno di tre upsweep modulati in frequenza da 17 a 20 kilohertz nell'arco di tre secondi della durata totale di nove secondi.
Inizia pulendo meticolosamente la superficie della piattaforma con etanolo al 70% per rimuovere i segnali olfattivi indesiderati. Sciacquare il rifugio con acqua ed etanolo al 70%, quindi lavare ancora una volta con acqua per attenuare l'odore dell'etanolo. Asciugare accuratamente sia la piattaforma che il rifugio poiché il topo potrebbe evitare di entrare nel rifugio se è bagnato.
Varia la posizione del rifugio nella piattaforma per ogni prova ruotando la piattaforma prima dell'esperimento. Quindi, porta il topo nella stanza degli esperimenti nella sua gabbia domestica e posiziona la gabbia accanto alla piattaforma di test per un periodo di acclimatazione di 10 minuti. Aggiungi due grammi di lettiera dalla gabbia domestica del topo all'interno del rifugio per fungere da segnale olfattivo locale.
Rimuovi il topo dalla sua gabbia domestica ed evita di recuperarlo per la coda. Prendilo a coppa o lascialo salire su un oggetto di arricchimento che può essere sollevato. Quindi, posiziona delicatamente il mouse al centro dell'arena e avvia l'acquisizione del video.
Consentire un periodo di assuefazione di sette minuti, durante il quale non viene presentato alcuno stimolo avversivo. Assicurati che il topo abbia abbastanza tempo per trovare ed entrare nel rifugio almeno una volta, ovvero quando tutti e quattro gli arti sono all'interno del rifugio. Successivamente, attiva automaticamente o manualmente l'erogazione dello stimolo visivo centrato sopra il mouse una volta che l'animale raggiunge una regione di interesse predefinita.
Per suscitare più di una risposta di fuga nella stessa sessione, consenti al topo di lasciare volontariamente il rifugio. Al termine del test, riportare l'animale nella sua gabbia di casa. Infine, pulisci la piattaforma e il rifugio prima di testare l'animale successivo.
I topi esposti a stimoli uditivi o visivi hanno avviato risposte di fuga rapida con brevi latenze tra l'inizio della stimolazione e l'inizio del volo. La latenza media per sfuggire allo stimolo era significativamente più lunga per la stimolazione uditiva rispetto a quella visiva. Inoltre, la navigazione verso il rifugio era accurata e le traiettorie di volo erano vicine a una linea retta attraverso i tipi di stimoli.
Dopo un periodo di acclimatazione di sette minuti al labirinto senza riparo, la presentazione di un lungo stimolo visivo ha prodotto un comportamento di congelamento invece di fuga. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 90 minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di presentare lo stimolo visivo sopra o sopra nella testa del topo, e non mentre il topo sta indagando sul bordo della piattaforma, poiché probabilmente mancherà lo stimolo.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del comportamento istintivo per esplorare il controllo delle conoscenze apprese rispetto al comportamento difensivo istintivo nei topi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come suscitare un comportamento difensivo nei topi e come usarli per studiare la navigazione spaziale durante le risposte di fuga.