Comportamentos defensivos instintivos são amplamente considerados hardwired-respostas aos estímulos, tais como o movimento de C-início em peixes e anfíbios, que move o animal longe de uma fonte de ameaça1. No entanto, comportamentos defensivos podem ser mais adaptáveis se flexìvel levam em conta as informações sobre o ambiente atual. Um exemplo de tal flexibilidade é o interruptor de fuga para congelamento mostrado por roedores quando confrontado com a ameaça, dependendo do conhecimento prévio sobre a presença ou ausência de um abrigo no ambiente2,3. Outros exemplos de flexibilidade em comportamentos inatas incluem adapta o limiar de início de voo ou escapar de velocidade dependendo da distância entre uma presa e seu abrigo4, distância anteriores e a ameaça de5,6, experiência 11 , 12, bem como selecionando diferentes estratégias defensivas, dependendo das propriedades sensoriais do estímulo aversive7, ou mesmo suprimir o comportamento defensivo face a concorrentes motivações como fome8, 9,10. A dependência de seleção de ação no conhecimento adquirido sobre as características espaciais do ambiente faz instintivos comportamentos defensivos em camundongos um poderoso modelo para o estudo objetivo seleção, memória espacial e navegação. Aqui, descrevemos a adaptação de uma tarefa comportamental comumente usada, a memória espacial de labirinto (BM) de Barnes do ensaio13, para determinar a influência do ambiente espacial na seleção de ação defensiva em ratos e suas estratégias de navegação quando fugindo em direção um abrigo.
O labirinto de Barnes padrão usado para estudar a memória espacial e aprendizagem em ratos consiste em uma plataforma de diâmetro circular ~ 90 cm com 20 furos igualmente espaçados, dos quais 19 estão fechadas, e um leva a um abrigo subterrâneo que ratos procuram a fim de evitar o campo aberto ambiente da plataforma. Estímulos aversive fracos (campainha, luz brilhante, ventilador) são frequentemente usados continuamente durante todo o ensaio para tornar o ambiente contrário e assim promover a entrada para o abrigo de14. No ensaio mais comumente usados15,16, o animal tem um julgamento de habituação onde pauta-se para o abrigo manualmente pelo experimentador imediatamente após ser posicionado na plataforma. Isto é seguido por um período de aquisição de 4 dias, onde cada dia que o mouse é permitido navegar livremente no labirinto por 3 min, após o qual novamente manualmente pauta-se para o abrigo se não alcançar, durante o período de exploração. A última fase do ensaio é uma sonda de julgamento sobre o 5º dia (embora uma memória a longo prazo de sete dias julgamento é também comumente realizada) quando o animal explora o labirinto com todos os buracos fechados. Aprendizagem e a longo prazo de memória são quantificados pelo tempo gasto para encontrar o abrigo e pokes nos buracos errados durante o período de aquisição e quando passei perto do furo de abrigo fechado no julgamento de sonda. Resultados típicos mostram uma diminuição do número de erros e latência para alcançar o abrigo durante a aquisição e uma proporção acima-oportunidade de tempo gasto no quadrante contendo o buraco fechado alvo da sonda experimental15.
Enquanto diversas variantes do ensaio BM têm sido descritas anteriormente17,18,19, o paradigma que descrevemos aqui tem três mudanças fundamentais de ensaio padrão. Primeiro, o animal é deixado para explorar o labirinto e encontrar o abrigo por conta própria, e teste é feito na mesma sessão, logo após o abrigo foi encontrado, durante os períodos onde o animal está envolvido em comportamento exploratório. Embora essa configuração não testar a memória de longo prazo, do local de abrigo, ele é projetado para ser um cenário naturalista que imita a exploração do novo território, sob a ameaça de predação. Além disso, permite testes de como animais se adaptar às mudanças agudas no ambiente, tais como mudanças bruscas na paisagem. Em segundo lugar, um aspecto fundamental do nosso ensaio é que o experimentador nunca força o animal dentro ou fora do abrigo, que pode desorientar o animal e excluir caminho integração20 como uma estratégia de navegação viável21. Integração do caminho é uma estratégia de navegação que utiliza sinais de auto-movimento, como pistas proprioceptivas e vestibulares, decorrentes da integração da saída do motor, para atualizar a posição atual do animal e navegar para um objetivo, que não é possível se o animal é deslocado passivamente pelo experimentador. Em terceiro lugar, usamos intrinsecamente contrário visual22 e estímulos auditivos23 para eliciar a fuga para o abrigo, que é facilmente distinguido do comportamento de forrageamento em curso e permite a avaliação e quantificação das estratégias específicas de navegação usado durante a defesa de ameaças iminentes. Propomos que este ensaio será útil para dissecar o papel da memória espacial na seleção e implementação de comportamentos defensivos, e mais geralmente para o mais amplo estudo de navegação objetivo-dirigido e a curto prazo memória espacial. Os protocolos descritos aqui foram introduzidos por Vale et al. em 2017, a que nos referimos aos leitores para mais na discussão de profundidade sobre a justificativa para as experiências e resultados.
Este ensaio pode ajudar a responder a questões-chave no campo da memória espacial, como como os animais navegam em direção a um local de meta recém-aprendido. A principal vantagem desse paradigma é que ele provoca um comportamento de navegação direcionado a objetivos etiologicamente importante que é desencadeado por estímulos sensoriais bem controlados e não requer treinamento prévio dos camundongos. Comece anexando dicas visuais à periferia da plataforma, que deve estar a pelo menos dois centímetros de distância da borda para evitar que os ratos as alcancem.
Prenda o abrigo à plataforma. Em seguida, posicione um diodo emissor de luz, ou LED, na entrada do abrigo para fornecer uma indicação de ponto de referência visual local. Em seguida, para isolar o mouse de pistas visuais distais externas, monte uma parede octogonal que se estende 40 centímetros acima e 15 centímetros abaixo da superfície da plataforma ao redor da arena, posicionada a 10 centímetros de distância da borda da plataforma.
Posicione um alto-falante de ultrassom 50 centímetros acima do centro da plataforma para fornecer estímulos auditivos aversivos e conecte uma placa de som e um amplificador a um alto-falante. Em seguida, coloque uma tela translúcida 64 centímetros acima da arena para projetar de volta os estímulos visuais aversivos usando um projetor. Calibre a luz do projetor para que haja de cinco a 10 terminais no centro da superfície da plataforma.
Coloque luzes infravermelhas e uma câmera infravermelha com um filtro passa-perda acima da plataforma para evitar a cintilação do protetor no vídeo adquirido. Em seguida, coloque o aparato comportamental dentro de uma caixa à prova de som e luz para evitar que pistas externas afetem o experimento. Por fim, use um software disponível comercialmente para rastrear a posição do mouse online.
Comece projetando os estímulos visuais na tela posicionada acima da arena. Acompanhe a posição do mouse online e predefina uma região de interesse na arena correspondente à localização do estímulo visual previamente definido, a fim de centralizar o estímulo visual acima do animal. Em seguida, teste o estímulo auditivo que consiste em um trem de três upsweeps modulados em frequência de 17 a 20 kilohertz ao longo de três segundos com duração de nove segundos no total.
Comece limpando meticulosamente a superfície da plataforma com 70% de etanol para remover sinais olfativos indesejados. Enxágue o abrigo com água e etanol 70% e, em seguida, lave novamente com água para diminuir o odor do etanol. Seque bem a plataforma e o abrigo, pois o rato pode evitar entrar no abrigo se estiver molhado.
Varie a localização do abrigo na plataforma para cada teste, girando a plataforma antes do experimento. Em seguida, traga o camundongo para a sala de experimentos em sua gaiola inicial e coloque a gaiola ao lado da plataforma de teste por um período de aclimatação de 10 minutos. Adicione dois gramas de roupa de cama da gaiola doméstica do rato ao interior do abrigo para servir como uma sugestão olfativa local.
Remova o mouse de sua gaiola inicial e evite recuperá-lo pela cauda. Coloque-o em concha ou deixe-o subir em um item de enriquecimento que possa ser levantado. Em seguida, coloque suavemente o mouse no centro da arena e inicie a aquisição do vídeo.
Permita um período de habituação de sete minutos, durante o qual nenhum estímulo aversivo é apresentado. Certifique-se de que o mouse tenha tempo suficiente para encontrar e entrar no abrigo pelo menos uma vez, que é quando todos os quatro membros estiverem dentro do abrigo. Em seguida, acione automática ou manualmente a entrega do estímulo visual centralizado acima do camundongo assim que o animal atingir uma região de interesse predefinida.
Para obter mais de uma resposta de fuga na mesma sessão, permita que o camundongo saia voluntariamente do abrigo. Após o término do ensaio, retorne o animal à sua gaiola de origem. Por fim, limpe a plataforma e o abrigo antes de testar o próximo animal.
Camundongos expostos a estímulos auditivos ou visuais iniciaram respostas de fuga rápidas com latências curtas entre o início da estimulação e o início do voo. A latência média para escapar do estímulo foi significativamente maior para a estimulação auditiva do que para a visual. Além disso, a navegação para o abrigo foi precisa e as trajetórias de voo estavam próximas de uma linha reta entre os tipos de estímulos.
Após um período de aclimatação de sete minutos ao labirinto sem abrigo, a apresentação de um longo estímulo visual produziu um comportamento de congelamento em vez de fuga. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 90 minutos se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de apresentar o estímulo visual acima ou acima na cabeça do mouse, e não enquanto o mouse estiver investigando a borda da plataforma, pois provavelmente perderá o estímulo.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do comportamento instintivo explorarem o controle do conhecimento aprendido sobre o comportamento defensivo instintivo em camundongos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como provocar comportamento defensivo em camundongos e como usá-los para estudar a navegação espacial durante as respostas de fuga.