Login processing...

JoVE Journal
Cancer Research

This content is Open Access.

JoVE Journal Cancer Research

Isolering og karakterisering af tumor initierende celler fra sarkom patient afledte Xenografts

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Journal (Cancer Research)

In Vivo EPR Assessment of pH, pO₂, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Journal (Cancer Research)

Patient-derived Heterogeneous Xenograft Model of Pancreatic Cancer Using Zebrafish Larvae as Hosts for Comparative Drug Assessment

Click here for the English version

Isolering og karakterisering af tumor initierende celler fra sarkom patient afledte Xenografts

Article DOI: 10.3791/57011-v

June 13th, 2019 •

Dan Han¹, Veronica Rodriguez-Bravo¹, Sudeh Izadmehr¹, Josep Domingo-Domenech¹, Carlos Cordon-Cardo¹

¹Department of Pathology, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

June 13th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Vi beskriver en detaljeret protokol for isolering af tumor initierende celler fra humane sarkom patient-afledte xenografter ved fluorescens-aktiveret celle sortering, ved hjælp af humant leukocytantigen-1 (HLA-1) som en negativ markør, og for yderligere validering og karakterisering af disse HLA-1-negative tumor-initierende celler.

Transcript

Vi opdagede, at HLA-I er epigenetisk ned reguleret i en delpopulation af kræftceller, der udviser stamcelleegenskaber og tumor-initierende kapacitet. HLA-I downregulation er direkte relateret til immun flugt, giver overlevelse fordele for kræft stamceller, hvilket gør HLA-I negativitet en nøjagtig funktionel markør for disse celler. Demonstration af proceduren vil være Sudeh Izadmehr, en postdoc fra vores laboratorium.

Ved erhvervelse af prøven anbringes vævet i en 100-millimeter petriskål i et steriliseret biosikkerhedsskab, og der tilsættes 500 mikroliter steril PBS til skålen. Brug en steril skalpel til mekanisk triturate vævet i små stykker, indtil ingen fragment er større end 0,1 millimeter. Hele PBS' 500 mikrolitervolumen overføres gennem en porecelles si på 35 mikrometer i et konisk rør med 50 milliliter.

Tilføj yderligere 500 mikroliter af PBS til vævsfragmenterne, og hak vævene igen. Derefter filtreres supernatanten gennem cellestemnet i samme opsamlingsrør, og vævestykkerne skal fortsættes, indtil prøven er helt dissocieret. Når den sidste mængde celler er blevet indsamlet, spin ned tumorceller ved centrifugering, og re-suspendere pellet i fem milliliter hæmolyse buffer.

Efter fem minutter ved stuetemperatur indsamles cellerne med en anden centrifugering, og pellet med yderligere fem milliliter PBS. Re-suspendere pellet i en milliliter PBS, og tælle de levedygtige celler. Cellerne fortyndes til en gange 10 til de syvende celler pr. 200 mikroliter PBS-koncentration på is, og der tilsættes 200 mikroliter kældermembranmatrix til cellerne med skånsom blanding.

Derefter injicere celle suspension-kælder membran matrix subkutant ind i flanken af en NOD scid gamma mus, og kontrollere væksten af tumoren på injektionsstedet to gange om ugen. Når tumoren når en centimeter i diameter, skæres tumoren i halve, og fastsætte halvdelen af xenograft med 4% paraformaldehyd natten over for histologisk analyse. Betjen anden halvdel af tumoren som netop vist at opnå en enkelt celle suspension, og fortynde cellerne til en to gange 10 til de seks celler pr milliliter PBS suppleret med 5% FBS koncentration.

Cellerne fastholdes på is i 30 minutter, før cellesuspensionen dividere en isotypekontrol og et antistofrør. Bemærk antallet af celler i hvert rør, og bland cellerne i antistofrøret med anti-HLA-antistof og cellerne i isotypekontrolrøret med et passende antiisotypekontrolantistof i en 90-minutters inkubation på is. Ved inkubationens afslutning opsamres begge cellepopulationer ved centrifugering efterfulgt af to 10-milliliter PBS vasker ved centrifugering.

Efter den anden vask suspenderes pellets igen i 10 mikrogram pr. milliliter DAPI til en gang 10 til de syv celler pr. milliliterkoncentration. Filtrer derefter hver celle suspension gennem en 35-mikrometer pore si i individuelle 12-by-75-millimeter polystyren rør. Efter fluorescensaktiv cellesortering fortyndes HLA-I-negative og positive cellepopulationer til individuelle en gange 10 til femte cellekoncentrationer i 15 milliliter af sarcosphere vækstmedium pr. delmængde.

Serielt fortyndes cellerne til en gange 10 til den fjerde, 10 til den tredje og 10 til den anden koncentration i 15 milliliter frisk sarcosphere vækstmedium pr. fortynding, og tilsæt 100 mikroliter celler fra hver fortynding til hver brønd af en 96-brønd ultra-lav vedhæftet filcellekulturplade per fortynding. Placer pladerne i en 37-graders Celsius, 5% kuldioxid cellekultur inkubator, overvågning af sarcosphere dannelse dagligt ved lys mikroskopi og tilføje friske grundlæggende fibroblast vækstfaktor og epidermal vækstfaktor til hver brønd uden at ændre mediet hver tredje dag. Efter tre uger tælles antallet af sarcosphere-positive og sarcosphere-negative brønde for hver cellefortynding af både HLA-I-negative og HLA-I-positive celler for at muliggøre beregning af den kugledannende cellefrekvens baseret på en Poisson-sandsynlighedsfordeling.

Typisk, human patient-afledt sarkom xenografts består af to forskellige HLA-I-positive og negative populationer, med en lignende histologi til, at påvist af forældrenes primære tumor. Fluorescens-aktiveret cellesortering af sarkom patient-afledte xenograft tumor-initierende celler som påvist letter berigelsen af et stort antal HLA-I-negative celler fra forældrenes cellepopulation. HLA-I-negative celler er i stand til at danne kugler med en indledende input af så lidt som 10 celler og udviser en højere tumordannelse evne end HLA-I-positive sarkom patient ankom xenograft tumor-initierende celler.

Injektion af det samme antal HLA-I negative og positive celler subkutanely i modsatrettede flanker af samme mus viser, at HLA-I-negative celler besidder en betydeligt højere tumordannelse evne. Mens xenografts dannet af både HLA-I negative og positive delpopulationer er cellulært heterogene tumorer. Endvidere, genekspression analyse af tumor-initierende celler afslører, at HLA-I-negative celler udtrykke stamceller differentiering markører og kan induceres til at differentiere langs både lipogenic og osteogenic veje, demonstrere stærk Olie-Red-O og Alizarin-Red-S farvning og kultur.

Denne metode kan bruges til at isolere kræft stamceller i forskellige menneskelige kræftformer. Molekylær karbonisering, for eksempel ved næste generation sekventering kan afsløre fælles markører for målretning af cellerne terapeutisk. Vores opdagelse viser, at restaureringen af HLA-I er et afgørende skridt for succes en funktionel enhed immuncelleforstørrelse strategier.

X

Simple Hit Counter