Immunology and Infection
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पूर्व वीवो मानव लसीकावत् ऊतक और मादा जननांग म्यूकोसा के मानव इम्यूनो वायरस 1 और Histoculture के साथ संक्रमण
Chapters
Summary October 12th, 2018
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मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) के साथ मानव ऊतकों के संक्रमण पूर्व vivo वायरस रोगजनन का एक मूल्यवान 3d मॉडल प्रदान करता है । यहां, हम प्रक्रिया के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन और मानव tonsils और एचआईवी के साथ मादा जननांग म्यूकोसा से ऊतक नमूनों को संक्रमित-1 और उंहें संस्कृति में बनाए रखने के तरल हवा अंतरफलक पर ।
Transcript
यह विधि एचआईवी क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रश्नों के उत्तर देने में मदद कर सकती है, जैसे संक्रमण से सबसे अधिक प्रभावित अंगों में से दो के भीतर वायरस संचरण और रोगजनन के निर्धारकों की पहचान। वास्तव में, प्रमुख उन्नत ड्राइविंग रोग प्रगति ऊतकों में होती है। संक्रमण की विशेषताएं और जटिलता परिसंचरण में कोशिकाओं द्वारा खराब रूप से परिलक्षित होती है या विट्रो में अलग और संक्रमित होती है।
एचआईवी रोगजनन का अध्ययन करने के लिए पूर्व वीवो ऊतक संस्कृति का मुख्य लाभ यह है कि यह कोशिकाओं के बीच अपने मूल स्थानिक और कार्यात्मक संबंधों को बरकरार रखता है, हालांकि दो से तीन सप्ताह के लिए। शुरू करने के लिए, सीएमटी के 20 से 30 मिलीलीटर के साथ 20 मिलीमीटर पेट्री डिश द्वारा 100 मिलीमीटर पानी भरें। बाँझ संदंश का उपयोग करके पेट्री डिश में जिलेटिन स्पंज को स्थानांतरित करें।
दोनों तरफ स्पंज गीला करें और स्पंज को एक मिनट के लिए मध्यम सोख लें। एक बाँझ स्पैटुला का उपयोग करके पेट्री डिश के नीचे के खिलाफ स्पंज को लगभग दो मिनट तक दबाएं। लगभग एक वर्ग सेंटीमीटर के बराबर आकार के टुकड़ों में रिहाइड्रेटेड जिलेटिन स्पंज को काटने के लिए बाँझ कैंची का उपयोग करें।
फिर एक संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में एक स्पंज टुकड़ा स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें। गर्भाशय ग्रीवा के लिए 12-अच्छी प्लेट में टॉन्सिल के लिए 6-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में सीएमटी के तीन से चार मिलीलीटर जोड़ें। इन्ब्रेक में प्लेटों को रखें, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 पर सेट करें, और 90% आर्द्रता से अधिक या बराबर जब तक ऊतक एक्सप्लांट स्पंज पर लोड होने के लिए तैयार नहीं होते हैं।
परिवहन कंटेनर से टॉन्सिल को बाँझ संदंश का उपयोग करके 10 से 20 मिलीलीटर सीएमटी युक्त 100 मिलीमीटर पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। टिश्यू को विच्छेदन करने के लिए पेट्री डिश के ढक्कन को काटने की सतह के रूप में इस्तेमाल करें। ऊतक को धीरे-धीरे संदंश के साथ पकड़ें, एक बाँझ स्केलपेल और ब्लेड का उपयोग करके प्रत्येक टॉन्सिल को अलग-अलग, बड़े टुकड़ों में काट लें।
कॉटराइज्ड, खूनी और फाइब्रॉएड टिश्यू को हटाने के लिए संदंश और स्केलपेल का उपयोग करें, साथ ही टॉन्सिलोलिस या हरे-भूरे रंग के रंग वाले किसी भी हिस्से का उपयोग करें। प्रत्येक ऊतक टुकड़े को मोटाई में लगभग दो मिलीमीटर के स्लाइस में काट लें। पिछले चरण की तरह किसी भी अवांछित भाग को हटा दें।
फिर ऊतक स्लाइस को दो मिलीमीटर मोटी स्ट्रिप्स में काट लें। अंत में, ऊतक स्ट्रिप्स को दो मिलीमीटर-मोटी ब्लॉक में काट लें। विच्छेदन के साथ आगे बढ़ते समय ऊतक विचेशन से बचने के लिए 10 से 20 मिलीलीटर सीएमटी वाले एक नए 100 मिलीमीटर पेट्री डिश में एक्सप्लांट्स को स्थानांतरित करें।
विच्छेदन के अंत में, एक्सप्लांट वितरण को यादृच्छिक बनाने के लिए प्लेट को घूमता है। प्रत्येक जिलेटिन स्पंज के शीर्ष पर नौ ऊतक एक्सप्लांट्स को 6-अच्छी प्लेट में संदंश का उपयोग करके रखें, जिससे उनके बीच की जगह हो। प्लेटों को इनक्यूबेटर में वापस कर दें।
आमतौर पर, एक्सप्लांट रातोंरात सुसंस्कृत होते हैं। एचआईवी के साथ टीका अगले दिन किया जाता है। यह सुनिश्चित करना है कि संस्कृति में कोई जीवाणु या फंगल संदूषण विकसित न हो।
इसके अलावा, कोशिकाएं विच्छेदन के तुरंत बाद ऊतक एक्सप्लांट्स को पीछे छोड़ देती हैं। एक पिपेट के साथ 6-अच्छी प्लेट में माध्यम को एस्पिरेट करें, और इसे कीटाणुनाशक समाधान के साथ एक कंटेनर में त्याग दें। प्लेट को झुकाएं और धीरे-धीरे जिलेटिन स्पंज को कुएं के ऊपरी हिस्से में धकेल दें ताकि माध्यम को नीचे इकट्ठा किया जा सके।
माध्यम को त्यागें और त्यागें। फिर प्रत्येक कुएं में तीन से चार मिलीलीटर सीएमटी जोड़ें। अब गल गल एचआईवी-1 वायरस की तैयारी पानी के स्नान में ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
एक जिलेटिन स्पंज पर नौ एक्सप्लांट में से प्रत्येक के शीर्ष पर सीधे वायरस इनोकुलम को पिपेट करें। थाली को इनक्यूबेटर में लौटाएं। टिश्यू को विच्छेदन करने के लिए पेट्री डिश के ढक्कन को काटने की सतह के रूप में इस्तेमाल करें।
ऊतक को धीरे-धीरे संदंश के साथ पकड़ें, म्यूकोसा की स्ट्रिप्स प्राप्त करने के लिए एक स्केलपेल और ब्लेड के साथ स्ट्रोमल और सबमुकोसा के नीचे से ectocervix और/या एंडोसर्विक्स के म्यूकोसा को अलग करें । म्यूकोसा को दो मिलीमीटर चौड़ी स्ट्रिप्स में काट लें। ऊतक की केवल दो मिलीमीटर मोटी परत को छोड़कर, जितना संभव हो उतना सबमुकोसा निकालें और त्यागें।
फिर स्ट्रिप्स को दो मिलीमीटर-मोटी ब्लॉक में काट लें। विच्छेदन के साथ आगे बढ़ते हुए ऊतक ों के त्याग से बचने के लिए सीएमटी के 10 से 20 मिलीलीटर युक्त एक नए 100 मिलीमीटर पेट्री डिश में ऊतक एक्सप्लांट स्थानांतरित करें। विच्छेदन के अंत में, एक्सप्लांट वितरण को यादृच्छिक बनाने के लिए प्लेट को घूमता है।
बाँझ संदंश के साथ, एक्सप्लांट को बाँझ 1.5 मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में स्थानांतरित करें। एक पिपेट का उपयोग करके ट्यूब में किसी भी माध्यम को हटा दें। इष्टतम परिणामों के लिए, सर्जरी के बाद गर्भाशय ग्रीवा के एक्सप्लांट को संसाधित और संक्रमित किया जाना चाहिए, आदर्श रूप से सर्जरी का दिन।
वैकल्पिक रूप से, ऊतकों को रात भर 4 डिग्री पर सीएमटी में डूबे हुए संग्रहित किया जा सकता है और विच्छेदन के तुरंत बाद संक्रमित किया जा सकता है। 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी स्नान में एचआईवी-1 तैयारी गल। एक बार गल जाने के बाद, वायरस को एक्सप्लांट युक्त ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
ट्यूबों को थर्मोशेकर में स्थानांतरित करें, और 300 आरपीएम पर कमाल के 37 डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। हर 30 से 60 मिनट में कई बार धीरे-धीरे ट्यूबों को उलटें। इस बीच, बाँझ फॉस्फेट बफर खारा के अच्छी तरह से प्रति तीन से चार मिलीलीटर के साथ एक 6 अच्छी तरह से थाली भरें ।
एचआईवी-1 के साथ इनक्यूबेशन के अंत में, कीटाणुनाशक समाधान के साथ एक कंटेनर में एक्सप्लांट युक्त ट्यूबों में सभी वायरस की तैयारी को त्यागने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। फिर पीबीएस युक्त 6-अच्छी प्लेट में एक्सप्लांट स्थानांतरित करने के लिए संदंश और एक पिपेट का उपयोग करें। एक्सप्लांट्स को कमरे के तापमान पर एक मिनट के लिए पीबीएस में आराम करने की अनुमति देने के बाद, उन्हें धीरे से पीबीएस को दो से तीन बार अच्छी तरह से ऊपर और नीचे पाइपिंग करके धोएं।
फिर पीबीएस को एक पिपेट का उपयोग करके कीटाणुनाशक समाधान के साथ एक कंटेनर में त्यागें। प्रत्येक कुएं में तीन से चार मिलीलीटर नए पीबीएस जोड़ें। कुल तीन वॉश के लिए दो बार और दोहराएं।
ऊतक desiccation से बचने के लिए स्पंज के लिए explants स्थानांतरित करने से पहले ही PBS त्यागें। अब प्रत्येक जिलेटिन स्पंज के शीर्ष पर पांच से आठ एक्सप्लांट को 12-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें। थाली को इनक्यूबेटर में लौटाएं।
एक पिपेट के साथ संस्कृति माध्यम का एक नमूना ले लीजिए, और इसे शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए बाँझ 1.5 या दो मिलीलीटर स्क्रू कैप ट्यूब में स्थानांतरित करें। बाँझ संदंश के साथ ऊतक एक्सप्लांट फसल, और बाँझ 1.5 या दो मिलीलीटर स्क्रू कैप ट्यूब में explants हस्तांतरण। प्रयोग की आवश्यकतानुसार ऊतक नमूनों की प्रक्रिया या भंडारण करें।
अवशिष्ट संस्कृति माध्यम को एक पिपेट के साथ कुएं में एएसपाइप करें, और इसे कीटाणुनाशक समाधान के साथ एक कंटेनर में त्याग दें। प्लेट को झुकाएं और धीरे-धीरे जिलेटिन स्पंज को कुएं के ऊपरी हिस्से में धकेल दें ताकि माध्यम को नीचे इकट्ठा किया जा सके, और फिर इसे एस्पिरेट और त्याग दें। अब प्रत्येक कुएं में तीन से चार मिलीलीटर संस्कृति माध्यम जोड़ें।
बाँझ संदंश का उपयोग करना, इनक्यूबेटर के लिए थाली लौटने से पहले जिलेटिन स्पंज के लिए माध्यम में गिरा दिया है कि किसी भी ऊतक explants वापस । संस्कृति के अंत में, खतरनाक जैविकों के साथ-साथ विशिष्ट जोखिम आकलन से निपटने के लिए संस्थान के नियमों के अनुसार ऐपोसाइट कंटेनरों में सभी जैविक कचरे का निपटान करें। अंतर दाता परिवर्तनशीलता एचआईवी-1 प्रतिकृति को प्रभावित कर सकते है के रूप में ऊतक एक्सप्लांट संस्कृति सुपरनैंट में एचआईवी कोर प्रोटीन p24 झूठ की एकाग्रता से मापा, के रूप में तीन अलग एक ही वायरस इनोकुलम से संक्रमित दाताओं से ग्रीवा ऊतक के लिए प्रदर्शन किया ।
पहले दाता के लिए, एचआईवी-1 बीएएल से संक्रमित एक्सप्लांट्स के संस्कृति माध्यम में p24 गैग का संचय स्पष्ट रूप से उत्पाद संक्रमण को इंगित करता है। एंटीरेट्रोवाइरल दवा 3टीसी जो एचआईवी प्रतिकृति को पूरी तरह से निरस्त करती है, का उपयोग नकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता था। 3TC-इलाज explants की संस्कृति माध्यम में मापा p24 झूठ की मात्रा वायरस inoculum के अंश से पता चलता है विशिष्ट रूप से अवशोषित और संस्कृति के दौरान ऊतक explants द्वारा जारी किया ।
दूसरे दाता से ऊतक explants में, एचआईवी-1 आंत्र संक्रमण समय के साथ p24 झूठ की एकाग्रता में लगातार कमी में परिणाम है, संक्रमण के एक गर्भपात या p24 चुप मात्राकरण द्वारा अज्ञेय का संकेत है । इसकी पुष्टि 3टीसी-इलाज नियंत्रण एक्सप्लांट्स द्वारा की जाती है जो समान एचआईवी प्रतिकृति गतिज दिखाते हैं। तीसरे दाता से ऊतक के विस्तार के संक्रमण से वायरस की मात्रा कम होती है।
इस मामले में, डी नोवो वायरस उत्पादन के साथ संक्रमण की उपस्थिति का पता लगाने के लिए नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 3टीसी उपचार को शामिल करना आवश्यक है। इस प्रक्रिया के बाद, प्रवाह साइटोमेट्री या इम्यूनोदाता जैसे विश्लेषणात्मक तरीकों को विभिन्न समय बिंदुओं पर किया जा सकता है ताकि ब्याज की कोशिका आबादी के फेनोटाइप, अनुपात या ऊतक स्थान के बारे में सवालों के जवाब दिए जा सकें। प्रयोग को डिजाइन करते समय, पसंद के प्रयोगात्मक readout पर अंतर-दाता परिवर्तनशीलता के प्रभाव का अनुमान लगाना महत्वपूर्ण है।
अंतर दाता परिवर्तनशीलता आंशिक रूप से कड़े नैदानिक और, संभवतः, प्रयोगात्मक समावेश और बहिष्कार मापदंड स्थापित करके नियंत्रित किया जा सकता है । पूर्व वीवो मानव ऊतक संस्कृतियों का उपयोग एचआईवी के अलावा अन्य रोगाणुओं के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि वैक्सिनिया वायरस या दाद वायरस। उन्हें रोगाणुरोधी विषाक्तता और नैतिकता अध्ययन के लिए एक प्रीक्लिनिकल प्लेटफॉर्म के रूप में भी इस्तेमाल किया गया है।
कृपया ध्यान रखें कि सभी मानव नमूने, यहां तक कि स्वस्थ व्यक्तियों से, संक्रामक एजेंटों को आश्रय दे सकते हैं। आप और आपके सहकर्मियों की सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए मानव ऊतकों को संभालने के लिए उचित शिक्षा, प्रशिक्षण और सुरक्षा की आवश्यकता होती है।
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