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背根神经节的原代培养常用于研究感官神经元的生理功能或病理相关事件。在这里, 我们展示了使用腰椎背根神经节的文化, 以检测神经递质的释放后神经元肽 FF 受体2型刺激与选择性激动剂。
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这种方法有助于回答感官研究领域的一些关键问题，如外周感知。这一技术的主要优点是，用最模拟生理状况的模型来研究感觉神经元的细胞机制。从两到三周大的老鼠的躯干中收集腰椎根。
首先沿着脊柱的两侧进行两次切口，一次横向切割，以标记腰椎的脊椎范围。然后，使用骨切钳去除脊柱的后肌。接下来，切除椎骨的后肢，露出脊髓。
然后使用解剖剪刀和钳子切除脊髓。通过计算上一根肋骨的椎骨来识别腰椎 DRG。此图显示了椎骨的位置。
使用微型剪刀收集从 L1 到 L6 的 12 个双边腰椎 DRG。去除任何附加的神经元纤维，以提高培养的纯度。将每个腰椎 DRG 转移到一个 35 毫米培养皿中，其中含有两毫升无冰冷血清介质。将含有 DRG 的 35 毫米培养皿转移到层罩中，用移液器用无血清介质清洗 DRG 三次。
使用无菌钳子将 DRG 移动到包含两毫升无菌胶原酶 1A 类型的新的 35 毫米培养盘中。将组织放在胶原酶溶液中，在37摄氏度的组织培养箱中放置30分钟，开始分离细胞。孵育后，去除胶原酶溶液，在汉克平衡盐溶液的两毫升中洗涤性干酶三次。
接下来，在培养皿中加入两毫升预预热0.05%的三辛EDTA，并像之前一样在培养箱中消化30分钟的 DRG。消化后，使用玻璃移液器将含 DRG 溶液的两毫升转移到 15 毫升离心管中。DRG 可能会粘在玻璃移液器上，因此应小心执行此步骤。
通过将含 DRG 溶液留在玻璃移液器的锥度端，并缓慢地（但无需暂停）将溶液转移到离心管中，可以避免实际损失。接下来，在摄氏4度下将溶液在290倍G下离心5分钟。离心后，去除上流剂，再加入两毫升无血清介质，重新下垂 DRG。
重复洗涤两次，使用两毫升预受的培养培养，在最后离心后重新暂停组织。使用先前准备的无菌火焰抛光移液器手动三角化 DRG 约 60 次。接下来，从CO2培养箱中去除一个涂有1毫升培养基的聚L-Lysine涂层24井板，其中含有1毫升培养基。
从菜中吸出孵化的培养培养。将 DRG 细胞从一只大鼠中播种到四口井中。这样，每井的播种密度约为50万个细胞。
第二天，用10微摩尔AraC和每毫升NGF100毫微克取代培养剂。在细胞电镀后的第三天，将培养素更改为0.5毫升的预预热无血清培养，并孵育一小时。在孵育过程中，在无RNase水的微升中加入50毫摩尔siRNA，每转染12.5微升无血清介质。
然后移液器2.5微升转染试剂进入10微升的无血清培养剂，每次转染。通过移液器混合两种溶液，并在室温下孵育这种混合转染溶液 10 分钟。10分钟后，将转染溶液加入含有 DRG 的 24 孔板的孔中，轻轻摇动混合。
经过6个小时的孵育，在每毫升NGF的每个细胞井中加入0.5毫升培养，20%FBS、10微摩尔阿拉克和100毫微克。最后，在37摄氏度的CO2培养箱中再孵育36小时。在电镀后的第六天和siRNA转染后72小时，将培养剂更改为200微升无血清介质。
经过30分钟的孵育，加入一微升的刺激化学物质，通过移液轻轻混合。此处使用 NPFFR2 激动剂、dNPA 和相应的车辆。在所需期间孵育后，从培养皿中收集培养基，并在5000次G下离心，在4摄氏度下5分钟，去除任何悬浮杂质。
从离心中收集上流液，并根据需要用磷酸盐缓冲盐水稀释。使用市售酶免疫测定试剂盒测定神经递质水平。第一天，箭头指示的单个神经元的细胞体附着在盘子的底部。
还存在箭头指示的胶质单元格。胶质细胞复制和扩展的过程，以包围感觉神经元的细胞体第二天，这个过程甚至更突出的第三天。在另一种培养文化中，CGRP蛋白被染色，以揭示神经元的形状。
CGRP蛋白染色出现在感觉神经元的细胞质和轴突中。神经元和胶质细胞的核形态在染色达皮时是截然不同的。神经元的核比胶质细胞更大、更圆。
相比之下，胶质的核形状更椭圆形。一旦掌握，这项技术可以在两个半小时，如果它执行得当。看完这段视频后，你应该对如何解剖和培养后根结节有一个良好的理解，并用它来研究潜在的生理功能的工具。
不要忘记，使用原细胞比使用常规细胞系困难得多，而执行这些程序时，温和总是最好的方法。
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