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Valutazione immunostimulatory agente: Attivazione linfoide tessuto estrazione e iniezione Route-dipendente delle cellule dendritiche
Chapters
Summary September 16th, 2018
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Procedure sperimentali per l'estrazione successiva di tessuti linfatici per testare l'attivazione delle cellule dendritiche linfoidi sono descritti dopo il trattamento di un nanomateriale immunostimulating.
Transcript
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di familiarizzare con la tecnica unica richiesta per isolare il linfonodo mediastino dai topi. L'operazione è stata condotta dopo aver iniettato materiale immunostimolante su sei diverse vie nei topi. In questo studio, abbiamo usato una nuova classe di materiali che formano strutture di dimensioni nanometriche.
I tensioattivi sono costituiti da gruppo testa idrofila e coda idrofobica. Questi formano micelle sferiche o altra struttura secondaria a causa della separazione dei microfagi. Abbiamo utilizzato questa proprietà per una bio macromolecola che è il DNA.
L'anfifilo del DNA, mostrato qui, come nucleotidi regolari come A, C, G, T, ha blocchi idrofili mentre le nucleobase neuro-cellulari modificate lipidiche agiscono come unità idrofobiche. L'oligo modificato è stato sintetizzato dal sintetizzatore DNA in ottogrammi su larga scala. Negli equi-media i DNA lipidici anfifili formano spontaneamente micelle sferiche di dimensioni nanometriche.
Quando si forma la micelle, il DNA rimane mono-filamento come vettore vuoto con circa 10 nanometri di diametro. Per dotare il vettore di immuno-stimolante, è semplice estendere la sequenza del DNA con recettore a pedaggio nove coadiuvanti vale a dire eCpG. Dna lipidico e base eCpG qui quindi la superficie esterna della micella viene degradata con sequenza CpG.
Quindi chiamiamo questa nanoparticcella immuno-stimolante come INP. Per determinare il modo corretto degli INP per la risposta immunitaria abbiamo iniettato INP ai topi in 64 vie di iniezione e di conseguenza è stato analizzato un tessuto linfonodo adeguato. Per istruzioni di iniezione più dettagliate si prega di trovare un articolo JOB pubblicato da Charles River nel 2012.
Il vantaggio principale di questo video è mostrare visivamente come ottenere il linfonodo mediastino. Il video mostra esplicitamente la posizione del linfonodo mediastino che molte persone trovano difficoltà nell'isolare gli organi. Tutti gli esperimenti sono stati condotti sotto le linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee presso lo Shanghai Public Health Clinical Center, o University of Ulsan College of Medicine.
Questa parte mostrerà la posizione specifica di organi o tessuti, che sono cruciali per l'analisi immunologica. Milza e due linfonodi saranno isolati. Prima di tutto, i topi sono stati sacrificati dall'eutanasia per inalazione di anidride carbonica e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo la sofferenza come segue la guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
D'ora in poi troviamo gli organi e li isoliamo. Per prima cosa, fissare correttamente il mouse sulla scrivania operativa con quattro perni sul palmo del mouse. Sterilizzare l'area di dissezione con alcol.
Sezionare la copertura esterna del fondo dell'addome del topo con una forbice di grandi dimensioni. Utilizzare le pin per aprire entrambi i lati dell'attacco e fissarlo con i perni sul tavolo operatorio. La posizione del linfonodo inguinale è esposta trovando la congiunzione del vaso che scende verso la gamba sinistra.
La forma del vaso sembra la lettera dell'alfabeto inclinato Y.Scopri lo strato con le forcep e tiralo dalla pelle. Tagliare il peritoneo con forbice più piccola per esporre gli organi interni. Spostare l'intestino a destra usando le forcep e quindi avvolgere la milza sagomata, che mostra sul lato sinistro, superiore sinistro dell'addome.
È necessaria un'ulteriore attenzione durante la procedura poiché la milza è facile da interrompere. Infine il punto chiave di questo video: raccolta del linfonodo mediastino. Si trova sotto il lato superiore del polmone, che è difficile da vedere a causa delle sue piccole dimensioni e della posizione un po 'nascosta.
Esporre attentamente l'area utilizzando piccole forbici e forcep. Tagliare entrambi i lati delle nervature e anche il diaframma. Ritagliare le costole tagliate sopra il petto.
Durante la procedura evitare di danneggiare il cuore e i vasi sanguigni poiché potrebbe accecare il sito, trovando il linfonodo mediastinico traslucido. Se per caso il vaso sanguigno scoppia, pulire delicatamente il sangue con una garza. Afferrare il lato sinistro del polmone e girarlo dolcemente dall'altra parte per vedere sotto il polmone.
Tirare su il linfonodo mediastino usando le forcep. Dopo aver raccolto il linfonodo mediastino, assicurarsi di rimuovere perfettamente tutto il grasso e il sangue che circondano il linfonodo poiché il tessuto indesiderato può influenzare l'analisi. Infine, tutti gli organi isolati su una piastra di Petri piena di media.
Totale 0,1 per 10 alla sesta cellule sono state analizzate su questa citometria del flusso. In base al getter di forza e alle dimensioni, la popolazione di leucociti getter fu recinta e le cellule furono escluse dalla colorazione scura. 24 ore dopo l'iniezione in INP per 64 vie di iniezione, milza, linfonodo inguinale e linfonodo mediastinico sono stati raccolti e analizzati l'attivazione CC per citometria del flusso.
Sulla base della strategia della citometria del flusso, la popolazione DC è stata definita come cellule positive cd11C e negative di lignaggio nel leucocita vivo. In particolare, l'iniezione intranasale di INP ha promosso aumenti significativi nell'espressione CD40, 80, 86 nel linfonodo mediastino rispetto al PBS per il controllo. Pertanto, questi dati hanno suggerito che l'iniezione intranasale di INP può essere utilizzata come coadiuvante mucoso per il miglioramento dell'immunità nel polmone.
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