Name: Bir damlacık dayalı mikrosıvısal yaklaşım ve Microsphere-PCR güçlendirme tek iplikçikli DNAAmplicons için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Öğrenin, damlacık tabanlı mikroakışkan platformlar ve mikrosfer-PCR ile tek iplikçikli DNA üretimini. Bu yöntem, ayrıştırma adımı olmadan homojen mikrosferler oluşturur ve hastalık teşhisi ile tedavisinde uygulanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışmada "kooperatif araştırma programı için tarım bilim ve teknoloji geliştirme (Proje No başlıklı bir proje tarafından desteklenmektedir PJ0011642) "Kırsal Kalkınma İdaresi, Kore Cumhuriyeti tarafından finanse edilmektedir. Bu araştırma da kısmen bir hibe (NMK-2017R1A2B4012253) temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı (Bilim Bakanlığı, ICT ve gelecek planlama, Kore Cumhuriyeti tarafından finanse edilen NMG) tarafından desteklenmiştir. Bu araştırma da bir grant (N0000717) tarafından eğitim programı yaratıcı ve Sanayi Ticaret Bakanlığı, sanayi ve enerji, Kore Cumhuriyeti tarafından finanse edilen yakınsama için destek verdi.

1. bir PDMS mikrosıvısal Platform imalatı
<ol><li>20 mL sıvı PDMS prepolymer temel polimer ve katalizör 10:1 bir hacim oranı karıştırarak hazırlayın. Silikon gofret için üst kısmındaki mikrosıvısal ağ üzerinde 10 mL sıvı PDMS hazırlanmış bir SU-8 kalıp üzerine dökün. Alt düz bölümü için bir kalıp yapısı olmadan silikon gofret sıvı PDMS aynı hacmi dökmek. Not: Mikrosıvısal ağ CAD programında tasarlanmış ve bir photomask tipik fotolitografi işlem (bkz: Tamamlayıcı rakamlar) kullanarak bir ana imal için dönüştürülür. Bu ana negatif fotorezist SU-8 kalıp silikon gofret11oluşur.</li>
	<li>Sıcak plaka ve tedavi için 30 dk. 75 ° C'de sıvı PDMS prepolymer ile kaplı iki silikon gofret yerleştirin.<ol>
<li>El ile SU-8 kalıp tedavi PDMS katmandan akasındaki. 1.5 mm çapında yuvarlak delik delme aracı mikron çaplı akış kanalları makro sıvı örnekleri ile arabirim için çoğaltılmış mikrosıvısal ağ üzerindeki yağ noktasına hizalayın. Üzerinden-el ile delik.</li>
		<li>Bu işlem üç kez iki çözüm ve çıkış bağlantı noktası oluşumu için delme işlemi yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hem üst hem de alt PDMS katmanları birkaç saniye örnek başına bir el corona treater12 kullanarak hidrofilik yüzey işleme gerçekleştirin.<ol>
<li>30 dakika sıcak bir tabak PDMS PDMS yapıştırma işlemi için kullanma iki plazma tedavi PDMS katmanları ve 90 ° C ısıda yığını. Yapısal bağ ve sızıntı fabrikasyon cihazın test için üç giriş liman şırınga pompa kullanarak basınçlı su.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Polyacrylamide Oligo-mikroküreler imalatı
<ol><li>Tablo 1' de ayrıntılı boncuk karışımı hazırlayın.</li>
	<li>Girdap ve kısaca santrifüj standart ssDNA acrydite sonda (Ap, 100 mikron) ve acrylamide:bis (19:1) hisse senedi çözüm etiketli.</li>
	<li>Çözüm hazırlamak ben % 40 akrilamid 25 μL bis çözüm, ssDNA (acrydite sonda) 10 μL, 5 x TBE arabelleği (1.1 M Tris; 900 mM bor; 25 mM EDTA) 10 μL ve su 5 μL karıştırma tarafından. Çözüm II ile % 20 amonyum Persülfat 50 μL hazırlayın.</li>
	<li>İki hazırlamak şırıngalar tek tek ben ve çözüm II çözüm ile doldurulmuş ve çözüm akar mikrosıvısal platformu tanıtmak için pompa üzerine mount. Mineral yağ ile % 0,4 karışık hazırlamak TEMED microsphere yüzey katılaşma için. Not: TEMED iyi bir serbest radikal sabitleyici bilinir. Serbest radikallerin polimer oluşumu ile amonyum Persülfat (APS) oranı akrilamid polimerizasyonu katalizler için hızlandırabilir.</li>
	<li>Bir cam şişe sürekli bir akış oluşturmak için mineral yağ 4 mL ile doldurulması.</li>
	<li>Bir mikrosıvısal rezervuar olarak cam şişe kapağı iki tüp iki bağlantı noktalarına ekleyin: hava kompresörü ve mikro kanal ağa basınçlı petrol temini için sıvı limana cam şişe içine sıkıştırılmış hava uygulamak için pnömatik bağlantı noktası Cam şişeden. Tüplerin arasında cam şişe ve mikrosıvısal aygıt petrol limanda bağlayın.<ol>
<li>Tüpler şırınga pompalar iki çözüm sağlamak amacıyla mikrosıvısal cihazın iki çözüm bağlantı noktalarına bağlayın. Oluşturulan microsphere kabı aktarmak için tüpler çıkış bağlantı noktasına takın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enjektör pompa debisi 0.4 - 0.7 mL/h. ayarlama basınçlı hava basınç regülatörü (82-116 kPa) kullanarak Kompresör için ayarlayın. Manyetik karıştırıcı çubuk dönüş hızı (500 rpm) cam kabı sıcak plaka üzerinde ayarlayın. Enjektör pompa çalıştırmak ve bir elektromanyetik valf13ON/OFF kontrolünü kullanarak cam şişe içine bir dış kompresör tarafından oluşturulan sıkıştırılmış hava tedarik.</li>
	<li>Mikroküreler akışı odaklanarak geometri oluşumu ve cam ölçek oluşturulan mikroküreler katılaşma dijital mikroskop gözlemlemek. Not: Microsphere boyut ve üretim hızına bağlıdır üzerinde debisi çözümleri ve mineral yağ akışı için uygulanan basınç (Tablo 2).
</li>
</ol>3. performans Polyacrylamide Oligo-mikroküreler sayar
<ol><li>Hemasitometre miktar için bir az miktarda (yaklaşık 100 μL) sulu çözüm polyacrylamide oligo-mikroküreler ve yerde bulunan cam hemasitometre al ve yavaşça microsphere süspansiyon kadar sayım odası iyi doldurun. Not: daha fazla ayrıntı için http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer bakın.</li>
	<li>Mikroskop ve el taksitli sayaç kümesi 16 kareler mikroküreler kullanın. Sonra hemasitometre odası sonraki kümesini taşıma ve 16 köşeler tüm dört setleri sayılır kadar güveniyor taşırlar.</li>
	<li>Ortalama microsphere sayısı belirlemek ve özgün boncuk süspansiyon mikroküreler sayısını hesaplayın.</li>
	<li>Mikroküreler 100 μL 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın. Nazik (400 x g) centrifuging ve pipetting aracılığıyla süpernatant kaldırın.</li>
</ol>4. performans gösteren DNA hibridizasyon Polyacrylamide Oligomicrosphere yüzeyi
Not: Bir aynı DNA prob 5'-NH2-5'-acrytide değişiklik yerine çözüm ben eklenir ve Ap içeren mikroküreler paralel olarak test. DNA hibridizasyon sonuçları Şekil 2' de gösterilmiştir. Cy3 etiketli tamamlayıcı oligonükleotid problar (cAp) çözüm karanlık bir odada yer almalıdır.
<ol><li>Cy3-kap 100 μL 1xTE arabellek kullanarak resuspend (TE arabellek: 10 mM Tris ve 1μM EDTA, pH 8.0) 100 mikron son bir konsantrasyon sağlamak için. Örneğin, TE arabellek ve alüminyum folyo ile kaplı bir microcentrifuge tüp transfer 100 ml kap 1 pmol resuspend. Not: strand dizileri için Tablo 3' e bakın.</li>
	<li>Cy3-kap 100 mikron mikroküreler Ap copolymerized içeren bir steril 1.5 mL microcentrifuge tüp için ekleyin.</li>
	<li>Tüp birkaç kez dokunun karıştırmak ve 1 h için karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>Süpernatant atmak ve pipetting aracılığıyla kalan arabellek kaldırın.</li>
	<li>Üç kez TE arabellek 500 μL ile yıkayın.</li>
	<li>Mikroküreler microcentrifuge tüp hafifçe dokunarak resuspend. O zaman, 4.4 adımları yineleyin.</li>
	<li>Mikroküreler görüntüleme önce alüminyum folyo ile kapatın ve cam slayt (75 mm x 50 mm) yerleştirin.</li>
</ol>5. asimetrik PCR ssDNA yükseltecek için
<ol><li>Asimetrik bir PCR reaktif mix ssDNA çözümlenmesi için yükseltecek için hazırlayın. Reaktifler buz üzerinde Tablo 4 çözülme. Buz Taq polimeraz enzimi (50 U/µL) tutmak değil, ama oldukça-20 ° C de ihtiyaç kadar saklayın.</li>
	<li>Yavaşça girdap tüm reaktifler ve sonra kısa bir süre santrifüj kapasitesi tüpler 10.000 x g 10 için de s.</li>
	<li>Açıklandığı gibi tüm reaktifler birleştirmek Tablo 4.
</li>
	<li>Örnekleri bir thermocycler yerleştirin ve aşağıdaki koşullar altında asimetrik PCR başlatmak: 25 devir (95 ° C 30 s, 52 ° C 30 s ve 72 ° C 30 s), 85 ° C 5 min için 4 ° C'de tutun</li>
</ol>6. Microsphere PCR ssDNA yükseltecek için
Not: Bu bölüm için ssDNA bir PCR reaksiyon tüp yükseltecek protokolünü açıklar. Microsphere-PCR reaksiyonları tepki birim 50 μL içinde gerçekleştirilmiştir. Detaylı dizileri ssDNA yükseltmek için kullanılan Tablo 5' te listelenen. Bu durumda, Ap mikroküreler yüzeyindeki rastgele DNA şablonları için tamamlayıcı bir şekilde tavlama. Bu tamamlayıcı DNA dizilerini (antianlamlı DNA dizisi, Şekil 3) üretimi için çok önemli bir adımdır. Genişletilmiş DNA microsphere-PCR güçlendirme için şablon olarak kullanılır.
<ol><li>Microsphere-PCR reaktif karışımı hazırlayın. Reaktifler Tablo 6 buz çözme; Ancak, Taq polimeraz enzimi buz üzerinde tutmayın. -20 ° gerekinceye kadar C'de depolayın.</li>
	<li>Yavaşça girdap tüm reaktifler ve sonra kısa bir süre santrifüj kapasitesi tüpler 10.000 x g 10 için de s.</li>
	<li>Yaklaşık ~ 25 mikroküreler mikroskobik sayma yoluyla elde edilir. Not: 40 X büyütme ile hafif bir mikroskop kullanarak bir tepki tüp mikroküreler sayısı hesaplanır. Yaklaşık 25 ~ mikroküreler microsphere-PCR güçlendirme için kullanılır. Daha ayrıntılı bilgi adım 3'de.</li>
	<li>Açıklandığı gibi tüm reaktifler birleştirmek Tablo 6.
</li>
	<li>Örnekleri bir thermocycler yerleştirin ve aşağıdaki koşullar altında asimetrik PCR başlatmak: 25 devir (95 ° C 30 s, 52 ° C 30 s ve 72 ° C 30 s), 85 ° C 5 min için 4 ° C'de tutun</li>
	<li>Aşağıdaki amplifikasyon, arabellek yükleme x 6 8 μL ekleyin ve her örneğinin 15 μL % 2 özel jel yükleyin. O zaman, 35 dk. 1 için 100 V Elektroforez gerçekleştirmek x TAE (Tris-asetat-EDTA, 40 mM Tris asetat, 1 mM EDTA, pH 8.2) arabellek.</li>
</ol>7. confocal mikroskobu edinme
Not: Microsphere-DNA prob hibridizasyon sonuçlarını confocal mikroskop altında görüntüsü. Görüntü analizi ImageJ kullanılarak gerçekleştirilir.
<ol><li>Mikroskop sahneye melezleşmiştir mikroküreler bir tutucu içinde düzeltmek.</li>
	<li>Lazer (helyum/Neon lazer, 543 nm hattı) seçin ve lazer denetiminde açın.</li>
	<li>Objektif lens mikroskop denetimi içinde seçin.</li>
	<li>Cy3 ve yapılandırma denetim kanalı için istediğiniz filtreyi seçin.</li>
	<li>Deneme başlatmak ve örnek gözlemlemek. Confocal mikroskop için ayarlar Tablo 7' de özetlenmiştir.</li>
</ol>

<ol><li>Smith, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+exonuclease+III+for+preparing+single+stranded+DNA+for+use+as+a+template+in+the+chain+terminator+sequencing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The use of exonuclease III for preparing single stranded DNA for use as a template in the chain terminator sequencing method.</a> Nucleic Acids Research. 6 (3), 831-848 (1979).</li>
<li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptabody-aptatope+interactions+in+aptablotting+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Aptabody-aptatope interactions in aptablotting assays.</a> Nanoscale. 9 (22), 7464-7475 (2017).</li>
<li>Ng, J. K., Ajikumar, P. K., Stephanopoulos, G., Too, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+RNA+polymerase-promoter+interaction+by+using+ssDNA-dsDNA+probe+on+a+surface+addressable+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Profiling RNA polymerase-promoter interaction by using ssDNA-dsDNA probe on a surface addressable microarray.</a> Chembiochem. 8 (14), 1667-1670 (2007).</li>
<li>Sekhon, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+copper+binding+aptamotif+and+aptamer+integrated+recovery+platform+%28AIRP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Defining the copper binding aptamotif and aptamer integrated recovery platform (AIRP).</a> Nanoscale. 9 (8), 2883-2894 (2017).</li>
<li>Mikhailov, V. S., Bogenhagen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Xenopus+laevis+mitochondrial+single-stranded+DNA-binding+protein+on+primer-template+binding+and+3%27--%3E5%27+exonuclease+activity+of+DNA+polymerase+gamma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of Xenopus laevis mitochondrial single-stranded DNA-binding protein on primer-template binding and 3'-->5' exonuclease activity of DNA polymerase gamma.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (31), 18939-18946 (1996).</li>
<li>Yu, X., Cheng, G., Zhou, M. D., Zheng, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-demand+one-step+synthesis+of+monodisperse+functional+polymeric+microspheres+with+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">On-demand one-step synthesis of monodisperse functional polymeric microspheres with droplet microfluidics.</a> Langmuir. 31 (13), 3982-3992 (2015).</li>
<li>Akamatsu, K., Kanasugi, S., Nakao, S., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-Integrated+Glass+Capillary+Device+for+Preparing+Small-Sized+Water-in-Oil-in-Water+Emulsion+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Membrane-Integrated Glass Capillary Device for Preparing Small-Sized Water-in-Oil-in-Water Emulsion Droplets.</a> Langmuir. 31 (25), 7166-7172 (2015).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-Flow+Synthesis+of+Co-Polymerizable+Oligo-Microspheres+and+Application+in+ssDNA+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">On-Flow Synthesis of Co-Polymerizable Oligo-Microspheres and Application in ssDNA Amplification.</a> PLoS One. 11 (7), e0159777(2016).</li>
<li>Anna, S. L., Bontoux, N. B., Stone, H. A. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.1537519">Formation of dispersions using &#34;flow focusing&#34; in microchannels.</a> Applied Physics Letters. 82 (3), 364-366 (2003).</li>
<li>Gupta, A., Matharoo, H. S., Makkar, D., Kumar, R. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0045793014002217">Droplet formation via squeezing mechanism in a microfluidic flow-focusing device.</a> Computers & Fluids. 100, 218-226 (2014).</li>
<li>McDonald, J. C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28dimethylsiloxane%29+as+a+material+for+fabricating+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices.</a> Accounts of Chemical Research. 35 (7), 491-499 (2002).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).</li>
<li>Olsen, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Microfluidic+Selex+Using+Free+Solution+Electrokinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Electrochemical+Society%22%5BJournal%5D)">Integrated Microfluidic Selex Using Free Solution Electrokinetics.</a> Journal of the Electrochemical Society. 164 (5), B3122-B3129 (2017).</li>
<li>Dorris, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodeoxyribonucleotide+probe+accessibility+on+a+three-dimensional+DNA+microarray+surface+and+the+effect+of+hybridization+time+on+the+accuracy+of+expression+ratios%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Oligodeoxyribonucleotide probe accessibility on a three-dimensional DNA microarray surface and the effect of hybridization time on the accuracy of expression ratios.</a> BMC Biotechnology. 3, 6(2003).</li>
<li>Heiat, M., Ranjbar, R., Latifi, A. M., Rasaee, M. J., Farnoosh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+strategies+to+optimize+asymmetric+PCR+conditions+as+a+reliable+method+to+generate+large+amount+of+ssDNA+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Applied+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Essential strategies to optimize asymmetric PCR conditions as a reliable method to generate large amount of ssDNA aptamers.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (4), 541-548 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

DsDNA kirletici ssDNA amplifikasyon içinde büyük bir sorun vardır. DsDNA amplifikasyon geleneksel asimetrik PCR güçlendirme15en aza indirmek zor kalır. SsDNA oluşturmak için teknik gelişmeler bizi örnek üretilen iş verimliliğini artırmak etkin olması, Ayrıca, ssDNA yalıtım eksik arıtma verimi ve yüksek maliyetler nedeniyle hala sorunlu olsa da.
Asimetrik PCR ssDNA ile çalışırken kullanılan en zorlu yöntemlerinden biridir. Bu yöntem astar (Örneğin, 20: 1 oranı) ...

Tek iplikçikli DNA (ssDNA) kapsamlı bir moleküler tanıma öğesi (MRE) olarak içsel özelliklerini DNA-DNA hibridizasyon1,2için nedeniyle kabul edilmiştir. SsDNA sentetik sistemlerinin geliştirilmesi DNA microarrays3, oligotherapeutics, tanılama ve tamamlayıcı etkileşimleri4,5dayalı entegre moleküler algılama gibi biyolojik uygulamalar yol açabilir.
Bugüne kadar mikrometre ölçekli polimer parçacıkları başarıyla mikrosıvısal aygıtlarını kullanarak gösterilmiştir. Birkaç mikrosıvısal teknikleri son derece homojen mikroküreler microchannel çevre6,7sürekli akışı üretmek için güçlü olduğu kanıtlanmış.
Lee ve ark. çalışmada 8, copolymerizable oligo-microsphere ve ssDNA amplifikasyon mikrosıvısal sentezi için bir mikrosıvısal damlacık tabanlı platform bildirildi. Mikrosıvısal platform iki PDMS (polydimethylsiloxane) katmandan oluşur: microsphere ve bir alt düz bölüm oluşturmak için bir mikrosıvısal kanal ağı ile bir üst kısmı. Bunlar PDMS sıvı kanallarını üç çeşit oluşur: Kanal damlacık üretimi için iki çözüm karıştırma için 2) bir yılan gibi kanal ve microsphere katılaşma için 3) bir sıralı polimerizasyon kanal odaklanarak 1) bir akış. Bir kez iki immiscible akar tek PDMS sıvı kanalı tanıttı, akar dar delik yapısı içerisinde zorlanacak. Kanal geometri, akış hızı ve viskozite gibi akışı davranışlar microsphere Morfoloji ve boyutu etkiler. Bu nedenle, ana sıvı akışı microscale monospheres9,10ayrılabilir.
Burada, detaylı microsphere-PCR Protokolü ssDNA güçlendirme için sağlanır. İlk olarak, bir damlacık tabanlı mikrosıvısal aygıt tasarım işlemi açıklanmıştır. Sonra hangi polyacrylamide mikroküreler rasgele DNA şablonuyla tamamlayıcı bir şekilde functionalized yolu açıkladı. Son olarak, ssDNA yükseltecek bir microsphere-PCR Protokolü gösterilir.

<table><tbody><tr><td>sıvı polidimetilsiloksan, PDMS</td><td>Dow Corning Inc.</td><td>Sylgard 184</td><td>Çip bileşenleri</td></tr><tr><td>% 40 Akrilamid: bis çözeltisi (19: 1)</td> <td>Bio-rad</td><td>1610140</td><td>Kopolimerize olabilen oligo-mikroküre bileşenleri</td></tr><tr><td>Amonyum persülfat, APS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3678</td><td>Akrilamid sertleştirici: bis çözeltisi</td></tr><tr><td>N, N, N ve asal;, N ve asal;-Tetrametiletilendiamin, TEMED</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9281</td><td>Amonyum persülfat katalizörü</td></tr><tr><td>Mineral yağ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M5904</td><td>Tablo 1. Çözüm III. Mikroküre reaktiflerinin bileşeni</td></tr><tr><td>Cy3 etiketli tamamlayıcı oligonükleotid probları</td><td>Bioneer</td><td>sentezlenmiş</td><td>Tablo 3. Sıra bilgisi&nbsp;</td></tr><tr><td>ssDNA akrilit etiketli prob</td><td>Bioneer</td><td>sentezlendi</td><td>Tablo 1. Çözüm I. Mikroküre reaktiflerinin bileşeni</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biosesang</td><td>&nbsp; T1016</td><td>TE tamponunun bileşenleri, pH tampon çözeltisi</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td>TE tamponunun bileşenleri, iyonun uzaklaştırılması (Ca2+)</td></tr><tr><td>Ex taq</td><td>Takara</td><td>RR001A</td><td>ssDNA amplifikasyonu</td></tr><tr><td>Konfokal mikroskop&nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>Mikroküre yüzeyinin açığa çıkması oligonükleotidlerin tanımlanması</td></tr>, <tr><td>Işık Mikroskobu,</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>tutulma 80i</td><td>Mikro kürecik sayısını hesaplama</td></tr><tr><td>T100 Termal Döngüleyici</td><td>Bio-rad</td><td>1861096</td><td>ssDNA amplifikasyonu</td></tr><tr><td>El Tipi Korona İşlemci</td><td>Elektro-Teknik</td><td>BD-20AC Laboratuvar Korona İşlemcisi</td><td>Hidrofilik yüzey işleme</td></tr><tr><td>Sıcak plaka</td><td>Sıvının kürlenmesi için</td><td>bir HI-1000</td> ısıtma plakası <td>olarak</td> PDMS</tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>kd Scientific</td><td>78-1100</td><td>Çözelti I ve Çözelti II'nin düzgün akışı</td></tr><tr><td>Kompresör</td><td>Kohands</td><td>KC-250A</td><td>Çözelti III'ün akış kontrolü</td></tr><tr><td>Parlak Çizgili Hemasitometre</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359629</td><td>Mikrokürelerin sayısının hesaplanması</td></tr></tbody></table>

bir damlacık dayalı mikrosıvısal yaklaşım ve microsphere-pcr güçlendirme tek iplikçikli dna'amplicons için

A Droplet-Based Microfluidic Approach and Microsphere-PCR Amplification for Single-Stranded DNA Amplicons

Damlacık tabanlı Havacilik sağlayan kontrollü boyutu ve elde edilen microsphere morfoloji mikrosıvısal kanaldaki homojen mikroküreler güvenilir üretim etkinleştirin. Bir acrydite-DNA prob ile copolymerized bir microsphere başarıyla fabrikasyon. Asimetrik PCR, eksonükleaz sindirim ve manyetik boncuklar streptavidin kaplı üzerinde yalıtım gibi farklı yöntemler tek iplikçikli DNA (ssDNA) sentezlemek için kullanılabilir. Ancak, bu yöntemleri verimli bir şekilde yüksek oranda saflaştırılmış ssDNA büyük miktarda kullanamazsınız. Burada, biz nasıl ssDNA olabilir etkili bir şekilde güçlendirilmiş ve dsDNA sadece bir PCR reaksiyon tüpünden pipetting tarafından ayrılmış ayrıntılı bir microsphere-PCR protokolü tanımlamak. SsDNA amplifikasyon DNA Mikroarray ve DNA-SELEX (sistematik evrimi ligandlar üstel zenginleştirme tarafından) işlemler potansiyel Kimyasalları olarak uygulanabilir.

Fabrikasyon polimer mikrosıvısal damlacık tabanlı platform iki PDMS kat (Şekil 1a) oluşur. Üç tür mikrosıvısal kanal ağları mikroküreler oluşturmak için kullanılır: Şekil 1b, karıştırma çözüm ben ve çözüm II için 2) bir yılan gibi kanal ve microsphere için 3) bir polimerizasyon kanal gösterildiği gibi 1) akışı odaklanarak geometri Katılaşma. Tüm kanallar yüksekliği 60 mikron oldu. Karıştırma ve polimerizasyon için kanal uzunluğu ...

Bu eser mikrosıvısal damlacık tabanlı platformlar imalatı ve polyacrylamide mikroküreler microsphere-PCR güçlendirme için uygulanması için bir yöntem sağlar. Microsphere-PCR yöntemi, Çift iplikçikli DNA ayıran olmadan tek iplikçikli DNA amplicons elde olanak verir.

Bir damlacık dayalı mikrosıvısal yaklaşım ve Microsphere-PCR güçlendirme tek iplikçikli DNA'Amplicons için

Droplet-based microfluidics enable the reliable production of homogeneous microspheres in the microfluidic channel, providing controlled size and ...

Bu yöntem, mikroakışkan sistemin kombinatoryal tekniğinde ve mikroakışkan cihazlar ve asimetri PCR yöntemi gibi moleküler biyoteknoloji alanındaki anahtar soruların yanıtlatılabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları, yüksek homojenleştirilmiş mikrokürelerin verimli üretimi ve ek ayırma adımları olmadan tek iplikli DNA üretimidir. Bu tekniğin etkileri çeşitli hastalıkların tanı veya tedavisine kadar uzanır.Tek iplikçikli DNA üretimi ap-ta-mo-sis tahlilleri için anahtar olduğundan, algılama ve tedavi için kullanılabilir. Bu yöntem MEMS'de üç boyutlu mikroakışkan sisteme ışık sağlasa da, hastalığın saptanması ve tedavisi için kullanılan diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni bireyler düzgün ters yönde akan sıvıları kontrol etmek için mücadele edecek.Bu yöntemin görsel gösterimi, oluşan mikrokürelerin akış odaklı geometrisinde ve katılaşmasında mikrosfer oluşumunu gözlemlemek için çok önemlidir. İlk olarak, baz polimer ve katalizör 10-bir oranında karıştırarak sıvı PDMS pre-polimer 20 mililitre hazırlayın. Mikroakışkan ağın üst kısmı için silikon gofret üzerine hazırlanmış bir SU-8 kalıbına 10 mililitre sıvı PDMS dökün.Alt düz parçası için, bir kalıp yapısı olm

a-droplet-based-microfluidic-approach-microsphere-pcr-amplification

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Damlacık tabanlı mikroakışkan platformları kHz oranları ucuza pikolitrelik, kendi kendine bölümlere damarları oluşturmak mümkün olduğundan yüksek kapasiteli deney için umut vaat eden adaylardır. Hızlı, hassas ve yüksek çözünürlüklü floresans spektroskopik yöntemleri ile entegrasyon sayesinde, bu sistemler içinde üretilen bilgilerin büyük miktarda verimli, ayıklanır, harnessed ve kullanılan olabilir.

Mikroakışkan damlacık platformları için Floresan algılama yöntemleri

Bu videoda, dijital polimeraz zincir reaksiyonu veya dPCR ile hedef nükleik asitleri tespit etmek için emülsifiye edilmiş nano damlacıklar oluşturmak için adım adım bir prosedür sunuyoruz.

Damlacık Dijital Polimeraz Zincir Reaksiyonu: Nadir Tümör Mutasyonlarını Tespit Etmek için Nanodamlacık PCR Reaksiyonları Oluşturmak İçin Bir Yöntem

Bu video, tek tüplü bir reaksiyonda oligonükleotid kaplı polimer mikroküreler kullanılarak tek sarmallı DNA'nın amplifiye edilmesi tekniğini açıklar. Bu işlem, DNA dizilimi ve mikrodizi analizi için daha fazla kullanılabilen saf tek sarmallı DNA verir.

Tek sarmallı DNA'yı Amplifiye etmek için Mikroküre Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Bu video, klinik tanı ve prognoz için erken bir biyobelirteç olarak farklı beyaz kan hücresi popülasyonlarında metillenmiş DNA bölgelerinin eş zamanlı olarak ölçülmesi için multipleks damlacık polimeraz zincir reaksiyonu tekniğini göstermektedir.

Lökositlerde DNA Metilasyonunu Tespit Etmek için Multipleks Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Bu video, DNA örneklerindeki tek nükleotid varyasyonlarının tespiti için tüp içinde çip formatında dijital PCR'nin faydasını göstermektedir. Tek bir PCR reaksiyonu, bağımsız PCR reaksiyonları olarak işlev gören odalara bölünür ve odalardaki güçlendirilmiş hedeflerden gelen floresan sinyallerinin tespiti, numunedeki varyant alelin frekansını hesaplamak için kullanılır.

Tek nükleotid varyantlarının miktar tayini için tüp içinde çip tabanlı dijital PCR

Basitleştirilmiş (analog) bir okuma ile nükleik asitleri ölçmek için bir uç nokta dijital testi tanımlıyoruz. Damlacık bazlı dijital tahlillerin toplu floresansını özel enstrümantasyon yerine standart bir qPCR makinesi kullanarak ölçüyoruz ve sonuçlarımızı mikroskopi ile doğruluyoruz.

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Tek hücreli sıralama genotypic heterojenlik biyolojik sistemlerde ortaya çıkarır, ama daha fazla işlem hacmi derin topluluk kompozisyon ve işlev profil oluşturma için gerekli güncel teknolojileri eksikliği. Burada, biz bir mikrosıvısal iş akışı sıralama için tarif &gt; 50.000 tek hücreli genleri farklı popülasyonlar hücre.

Tek hücreli genom sıralama için bir üretilen iş Ultrahigh mikrosıvısal Platform

Burada, doğru bir şekilde birden fazla genetik değişiklikler hedef bölge teslim ddPCR ve hidroliz probları benzersiz bir çift kullanarak tek bir tepki olarak ölçmek için bir protokol mevcut.

Tek damlacık dijital polimeraz zincir tepkimesi mutasyonlar Hotspot bölgelerde kapsamlı ve eşzamanlı algılanması için

Burada, hastanın biyolojik sıvılarında (biyoluidler) bulunan DNA 'Yı dolaşarak tümör somatik mutasyonları tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) tabanlı yöntem, tümör mutasyonu allelik frekansının (MAF) ölçülmesini sağlar ve tümör yanıtının tanı ve temporal izlenmesi için minimal invaziv bir tamamlayıcı kolaylaştırır.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Epigenetik belirteçler beyaz kan hücresi (WBC) DNA metilasyon desenleri nicelik selektib yoluyla subtyping için kullanılır. Bu protokol, WBC diferansiyel sayımlarının hassas ve çok katlı metilasyona özgü hedef nicelemesine olanak sağlayan damlacık üretimi için termoplastik elastomer (TPE) tabanlı mikroakışkan bir cihaz kullanılarak çok katlı damlacık polimeraz zincir reaksiyonu (mdPCR) yöntemi ni sunar.

Hematolojik Tanı için Polimer Damlacık Jeneratör Cihazı ile Metilasyona Özgü Multipleks Damlacık PCR

Yağdaki su damlacık tahlilleri analitik kimya, enzim evrimi ve tek hücre analizi için yararlıdır, ancak tipik olarak damlacıkları oluşturmak için mikroakışkanlar gerekir. Burada, damlacık tahlillerini gerçekleştirmek için mikroakışkan içermeyen bir yaklaşım olan parçacık şablonlu emülsifikasyonu açıklıyoruz.

Parçacık Şablonlu Emülsifikasyonu MikroakışkanSız Damlacık Tahlillerini Mümkün

Öğrenin, damlacık tabanlı mikroakışkan platformlar ve mikrosfer-PCR ile tek iplikçikli DNA üretimini. Bu yöntem, ayrıştırma adımı olmadan homojen mikrosferler oluşturur ve hastalık teşhisi ile tedavisinde uygulanır.