Protocollen voor het testen van de toxiciteit van roman insecticide chemicaliën aan muggen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de insecticide detectie en vector controle velden. Zoals, hoe giftig is een ongeformuleerde chemie voor een populatie muggenlarven of volwassenen? Heeft de chemie potentieel voor ontwikkeling als een larvicide of adulticide?

En, wat is misschien wel de meest effectieve leveringsroute? De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het kan worden gebruikt om de toxiciteit van ongeformuleerde chemie te evalueren De toxiciteit van een chemie tegen meerdere soorten vectormuggen, en het kan worden opgeschaald tot honderden verbindingen in hoge doorvoercapaciteit te evalueren. Het aantonen van de procedure zal Jasleen Kaur zijn, een wetenschappelijk technicus uit mijn laboratorium.

Om te beginnen, label de putten van een 24-well weefsel kweekplaat. Gebruik een analytische balans om de testverbinding te wegen. Laat de verbinding vervolgens in steriel dubbel gedestilleerd water in een buis van 1,5 mL af, wat resulteert in een voorraadoplossing van 80 m.

Verdun vervolgens de voorraadoplossing in serie met dubbel gedestilleerd water om werkvoorraadoplossingen van de gewenste concentraties voor te bereiden. Houd er rekening mee dat de larven moeten worden genomen aan de putten, tijdens het verwijderen van overtollig water en wanneer de testchemie wordt toegevoegd om fysieke schade aan de larven te voorkomen. Letsel kan de sterfte verhogen, en dus vals-positieve resultaten opleveren of de test ongeldig maken.

Gebruik een breedborze plas plastic overdracht pipet om vijf derde instar larven over te brengen op elke put van de plaat. Gebruik vervolgens een 1 mL pipet om het water voorzichtig te verwijderen en te vervangen door het gewenste volume dubbel gedestilleerd water. Zorg ervoor dat u de larven niet aanraakt wanneer het water snel wordt verwijderd om ervoor te zorgen dat de larven niet uitdroven en voeg voorzichtig de testchemie toe door tegen de andere kant van de plastic put te pipetten.

Voeg een passend volume van het testen oplossing aan elke put, en draai voorzichtig de plaat om een gelijkmatige mengen te garanderen. Plaats de plaat in een groeikamer met een licht/donkere cyclus van 12 uur bij 25 graden Celsius met een relatieve luchtvochtigheid van 75 tot 85 procent. Tik op de plaat om de verplaatsing van larven te controleren.

Als er geen beweging wordt waargenomen, raak de larve voorzichtig aan met een steriele tandenstoker. Scoor de larve als dood als er geen reactie wordt opgemerkt, en gebruik een scoreblad om het totale aantal dode larven in elke put vast te leggen, op het tijdstip dat in het tekstprotocol wordt beschreven. Cultuur drie tot vijf dagen oude volwassen vrouwelijke muggen in een 20 liter plastic kooi.

Label negen ounce papieren bekers met de naam en concentratie van het testen van verbinding. Bereid vervolgens een 10mg/mL voorraadoplossing van de teststof in aceton in een 20mL glazen flacon. Verdun vervolgens in serie de voorraadoplossing om de gewenste werkconcentraties te verkrijgen.

Maak de ene mL-glasspuit schoon met aceton. Vul deze vervolgens met de testoplossing bij de juiste concentratie. Beveilig de spuit in een micro-applicator aangepast om een volume van 0,25uL te leveren.

Gebruik vervolgens een aspirator om 10, 3 tot vijf dagen oude volwassen vrouwelijke muggen uit de kooi te verwijderen. Verdoof ze vijf minuten bij vier graden Celsius. Breng de muggen vervolgens over op een petrischaaltje.

Zet de schotel 10 minuten op ijs. Om te voorkomen dat de volwassen mug beschadigd wordt, wat kan bijdragen aan de sterfte, moet u ervoor zorgen dat ze niet langer dan vijf minuten in de koelkast worden verdoofd of langer dan 10 op ijs worden geïmmobiliseerd en de behandeling van de muggen minimaliseren. Als u toegang hebt tot een koude plaat, en een micromanipulator met een beweegbaar stadium, kan dat de behandeling van de muggen verder minimaliseren.

Gebruik fijne pincet om elke mug uit de schotel te verwijderen. Met de spuit micro-applicator van toepassing 0.25uL van het testen oplossing op de dorsale thorax, onder een ontledenmicroscoop Vervolgens, breng de muggen naar een gelabelde papieren beker op ijs. Verzegel de beker met een 10 bij 10cm mesh vierkant en een elastiek Vervolgens, breng het naar de groeikamer, en record het aantal dode muggen zoals eerder beschreven.

Verzamel ongeveer 150 vier tot vijf dagen oude volwassen vrouwelijke muggen met een aspirator, en breng ze naar een aparte kooi. Verwijder de bron van suiker een tot 24 uur voor de voeding test. Bereid een 80mM voorraadoplossing van de teststof in water.

Verdun het vervolgens in serie met water, om werkvoorraadoplossingen van de gewenste concentraties te verkrijgen. Om de gewenste testconcentraties te verkrijgen, voeg 40uL van elke verdunning toe aan 960uL gedefibrineerd konijnenbloed in een buis van 1,5 mL en meng door pipetting. Plaats een lidfilter op een voerunit en sluit deze af met een rubberen ring.

Gebruik vervolgens een pipet om een mL van het bloed met testoplossing door de leveringspoort te brengen, gelegen aan de achterzijde van de voedingseenheid. Bevestig de voerunit aan een verwarmingsunit. Dan, wattenstaaf het membraanoppervlak voorzichtig met vers bereide 10 procent melkzuuroplossing.

Plaats de voerunit in de kooi. Bedek de kooi met een donkere doek, en laat de muggen te voeden voor een uur. Nadat de muggen zich voeden, plaats de kooi in een koelkast op vier graden celsius gedurende vijf minuten om de muggen te verdoven.

Tel en neem het totale aantal muggen in de kooi vast. Door het onderzoeken van de buik, tellen en registreren het totale aantal volledig en gedeeltelijk gevoede vrouwelijke muggen. Per dosis moeten minimaal 50 gevoede muggen in bloed worden verkregen.

Verwijder alle muggen die niet hebben gevoed. Breng de kooi vervolgens over naar een groeikamer en gebruik een scoreblad om het aantal dode muggen op de juiste tijdstippen vast te leggen. Op dag drie na het bloed voeden, plaats een eierkop in de kooi voor 72 uur.

Gebruik een ontleedmicroscoop om het totale aantal eieren per behandeling te tellen. Een larve contacttest werd uitgevoerd om het effect van amitriptyline, een dopamine receptor antagonist, op larve mortaliteit na verloop van tijd te evalueren. Uit de gegevens bleek dat de LC 50-waarde in de loop van het experiment afneemt.

Het effect van amitriptyline op de mortaliteit van volwassen vrouwelijke muggen werd vergeleken met bifenthrin, en twee negatieve controles. In vergelijking met aceton behandeld en onbehandelde negatieve controles, zowel amitriptyline en bifenthrin veroorzaakt significante sterfte op elk experimenteel tijdstip. Een kwantitatieve voedingstest werd uitgevoerd om het effect van drie verschillende doses amitriptyline op fecunditeit en procent mortaliteit van volwassen vrouwelijke muggen te evalueren.

De gegevens toonden geen statistisch significant verschil in de fecunditeit van amitriptyline gevoed muggen bij de hoogste dosis in vergelijking met alleen bloed gevoed controles. Eenmaal onder de knie, een van de tests die we hier hebben beschreven, kan worden voltooid in ongeveer twee uur door een enkel individu, indien goed uitgevoerd. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om voorzichtig omgaan met het organisme, en er moet consistentie tijdens actuele toepassingen en tijdens het scoren van larve of volwassen test.

Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals bio-assays om toxiciteit te evalueren via absorptie, via de mosquito tarsi, de CDC-flestest en de WHO-buistest om aanvullende vragen te beantwoorden met betrekking tot de werkzaamheid van de niet-geformeerde chemie, of een geformuleerd product, en potentieel voor ontwikkeling als insecticidecontact of ruimtespray.