Manipulere levende celler å konstruere stabil 3D Cellular samling uten kunstige stillas

Denne nye metodikken gjør det mulig for oss å konstruere tredimensjonale forsamlinger, tilpasset fra ønskede individuelle celler, i en vandig bufferløsning som inneholder uspesifikk hydrofil polymer, ved å etablere stabil cellecellekontakt. I denne videoen vil vi demonstrere hvordan vi manipulerer ønskede enkeltceller og konstruerer 3D-cellulære samlinger uten kunstig stillas. Her vil vi vise den eksperimentelle prosedyren i vårt medium med Dextran som et eksempel.

Til å begynne med, opprettholde NAMRU mus brystkjertel epitelceller med fem milliliter DMEM, som inneholder 10% FBS og 1% Penicillin-Streptomycin, i en 25 kubikkcentimeter kolbe i to til tre dager. Når du er klar til å fortsette, bruk en aspirator for å fjerne den supplerede DMEM og legge til tre til fem milliliter PBS, som er forvarmet til 37 grader Celsius for å vaske cellene. Bruk en aspirator til å fjerne alle PBS-ene fra kolben.

Tilsett 1,5 milliliter trypsin som er forvarmet ved 37 grader Celsius. Inkuber i en CO2 inkubator ved 37 grader Celsius i minst ett til to minutter. Etter dette, legg til 3,5 milliliter DMEM som inneholder 10% FBS og 1% Penicillin-Streptomycin.

Pipetten opp og ned for å blande. Overfør cellefjæringen til et 15 milliliter sentrifugerør og sentrifuger den ved 417 ganger G i tre minutter ved romtemperatur. Deretter aspirerer mediet.

Tilsett fem millimeter fersk DMEM som inneholder 10% FBS og 1% Penicillin-Streptomycin. Og om nødvendig, bruk en kryopreservasjonsløsning for å kryoreserve cellene som beskrevet av produsentens instruksjoner. Første blanding 10 milliliter DMEM supplert med 10% FBS og 1% Penicillin-Streptomycin med 0,8 gram Dextran, for å forberede en 80 mg per milliliter Dextran løsning.

Bland 200 mikroliter av denne Dextran-oppløsningen med 200 mikroliter av den tidligere forberedte cellefjæringen, for å lage en cellesuspensjon som inneholder 40 milligram per milliliter Dextran-medium. For å begynne, slå på laser, merk at bruk av en laserstråle med en bølgelengde i den røde til nær-infrarøde regionen er mest effektiv. Åpne deretter programvaren ved å dobbeltklikke på programvareikonet.

Dobbeltklikk på ikonet for kameraet, og legg merke til at den tilsvarende skjermen vil dukke opp. Dobbeltklikk deretter på ikonene for lysdioden, fokusjusteringen og det bevegelige stadiet for å åpne skjermene også. Først plasserer to glass avstandsstakere på bunndekselet glass lysbilde.

Overfør 20 mikroliter, den tidligere forberedte Dextran-supplert cellefjæring på bunndekselets glasssklie. Plasser deretter toppdekselglasset på avstandsslene som dekker cellefjæringen. Plasser prøvecellen på den nedre objektive linsen med 10 mikroliter destillert vann for vannsenking mikroskopi.

Fest den øvre objektive linsen øverst i prøvecellen ved hjelp av 10 mikroliter destillert vann. Deretter klikker du på av/på-knappen i vinduet for belysning av mikroskop for å slå på LED-lampen. Klikk på retningsknappene i vinduet for objektiv posisjonering for å justere avstanden mellom prøven og det nedre objektivobjektivet til det er i fokus.

Sett intensiteten på hver laserstråle til 1500 milliwatt i signaldepingsvinduet. Deretter klikker du på de to laserikonene for å bestråle laserstrålene i posisjon en og posisjon to. Klikk på retningsknappene i eksempelposisjoneringsvinduet for å flytte prøvestadiet til en celle er fanget i posisjon en.

Klikk og dra markøren som angir posisjon to til en annen celle er fanget i posisjon to. For å begynne, manipulere en enkelt celle, slik at den er i kontakt med en annen celle. Oppretthold denne tilstanden i 300 sekunder, slik at cellen blir utsatt for en laser i 300 sekunder.

Ta opp x-y-aksen. Trap en annen celle og transportere den til de to første cellene for å konstruere en vilkårlig 2D-cellemontering. Flytt deretter scenen opp og ned for å konstruere en 3D-mobilenhet.

Kontroller at enheten fortsatt er stabil selv etter at laseren er slått av. I denne studien brukes oppløselige polymerer i konstruksjonen av 3D-encelleenheter. En eksempelstruktur dannet ved hjelp av dobbeltstråle optisk pinsett er vist her.

Hvis eksperimentet er vellykket, forblir disse cellulære samlingene stabile selv etter at laseren er slått av. Denne nye metodikken er for bygging av 3D-cellulære forsamlinger i et vandig medium med naturlig hydrofil polymer. Det forventes å starte byggingen av slike typer neste generasjons cellulære forsamlinger med noen av de kraftige verktøyene innen regenerativ medisin og vevsteknikk.