尽管二维细胞培养在癌症研究中被广泛应用，但其存在局限性，因为细胞以单层形式生长，营养物质和氧气浓度均一。这类培养体系缺乏天然肿瘤微环境（TME）中存在的关键细胞间及细胞与基质间的相互作用。因此，这些模型难以真实模拟生理条件，导致细胞行为异常，包括形态不自然、受体分布紊乱、膜极性改变以及基因表达异常等多种情况1,2,3,4另一方面，三维细胞培养技术通过在立体空间中以细胞聚集体、球状体或类器官的形式扩增细胞，提供了一种可构建更精确模型的替代方法 体外 环境以研究细胞生物学和生理学的基本问题。3D细胞培养模型还可促进细胞与细胞外基质（ECM）之间的相互作用，这种相互作用是原生肿瘤微环境（TME）的关键生理特征 体外1,4,5新兴的3D生物打印技术为构建模拟异质性肿瘤微环境的模型提供了可能。
3D生物打印技术源于快速成型技术，能够制造出可模拟某些活体组织样本复杂性的3D微结构6,7目前的生物打印方法包括喷墨打印、挤出打印和激光辅助打印8其中，挤出法可通过将不同类型的材料精确定位在初始位置不同的区域，从而在打印的基质中控制异质性。因此，该方法是制备异质结构的最佳途径 体外 涉及多种细胞或基质的模型。挤出式生物打印已成功用于构建耳廓形状的支架9血管结构10,11,12以及皮肤组织13，从而实现高打印保真度和细胞活性。该技术还具有材料选择多样、可沉积含有已知密度包埋细胞的材料以及高重复性等优势。14,15,16,17天然和合成水凝胶因其生物相容性、生物活性以及可被设计成在结构上模拟细胞外基质（ECM）的亲水性网络，常被用作3D生物打印的生物墨水7,18,19,20,21,22,23水凝胶还具有多种优势，因其可包含细胞黏附位点、结构组分、对营养物质和气体的通透性，以及适宜的机械性能，从而促进细胞生长发育。24例如，胶原蛋白水凝胶可为细胞提供整合素锚定位点，使其能够附着于基质。明胶是变性的胶原蛋白，仍保留类似的细胞黏附位点。相比之下，海藻酸盐具有生物惰性，但可通过与二价离子交联而提供机械稳定性。25,26,27,28.
在本研究中，我们开发了一种由海藻酸盐和明胶组成的复合水凝胶作为生物墨水，其微观结构类似于天然肿瘤间质。将乳腺癌细胞和成纤维细胞包埋于该水凝胶中并进行打印。 通过 基于挤出的生物打印机构建模拟的三维模型 体内 微环境。这种人工构建的三维环境可使癌细胞形成长期培养下仍具有高存活率的多细胞肿瘤球（MCTS）。> 30天）。本实验方案展示了复合水凝胶的合成方法、材料微观结构与可打印性的表征、细胞异质模型的生物打印，以及多细胞球（MCTS）形成过程的观察。这些方法同样可应用于挤出式生物打印中的其他生物墨水，以及具有不同设计的异质组织模型，有望用于药物筛选、细胞迁移实验及细胞基本生理功能的相关研究。
该方法有助于回答癌症生物学领域的关键问题，例如肿瘤形成、细胞迁移追踪以及癌细胞与正常细胞间的信号传导。该技术的主要优势在于，它能够在包含成纤维细胞等间质细胞的三维环境中研究肿瘤发生，且成本较低、可重复性高。确保材料兼具生物可打印性和生物功能性至关重要，这需要对其流变学特性和细胞相容性进行定量研究。
该方法的可视化演示至关重要，因为水凝胶制备及细胞与水凝胶混合步骤较难掌握，气泡的形成会干扰打印模型的准确性。在生物安全柜中，将三克海藻酸钠和七克明胶粉末加入250毫升烧杯中。放入磁力搅拌子，并加入100毫升DPBS。
用无菌石蜡膜和铝箔密封烧杯，以避免污染。然后向受试者展示与其肌电图（EMG）模式相对应的独特且特定的极坐标图。此后，在室温下继续振荡两小时。
将溶液在 37 摄氏度下加热，直至凝胶发生相变转变为液态。然后将溶液转移至无菌的 50 毫升锥形离心管中并密封。以 834 ×g 离心 5 分钟，以去除任何气泡。
接下来，将水凝胶前体吸入10毫升注射器中。用帽盖和石蜡膜密封注射器，并在4°C下保存，直至使用前。
准备开始测试时，将装有制备好的水凝胶前体的注射器放入37摄氏度水浴中恒温一小时。在此期间，开启并初始化流变仪。一小时后，将注射器从水浴中取出。
将约 0.5 毫升前驱体挤出至流变仪平台。在控制面板上，点击向下的三角形按钮。等待测量工具下降至修整位置。
使用刮刀修剪掉从测量工具边缘溢出的多余前体材料，并丢弃多余的物质。然后用移液管将矿物油滴加到测量工具的边缘，等待油完全封闭边界。
在控制面板上，单击“继续”。然后单击“开始”按钮。测试完成后，松开测量工具，然后单击向上的三角形按钮。
移除测量工具。使用70%乙醇清洁测量工具和平台。首先，按照文本方案中所述完成振幅和温度扫描。
开始等温时间扫描时，点击“我的应用程序”，然后点击“等温时间-温度测试”模板。在工作流程中点击“测量”步骤，接着点击变量振荡应变，并调出设置窗口。
将振荡应变设置为0.1%，振荡频率设置为1赫兹。在弹出窗口中，将数据点数设置为120。数据采集频率设置为每分钟采集一个数据点。
单击“添加”按钮以添加温度变量。单击变量“temperature”，并将其设置为 25 摄氏度。在工作流程中右键单击步骤“Device, Move to measuring point”。
单击“删除”。然后单击步骤“设备，设置值”。取消勾选“等待达到设定值”复选框，并将数值设置为 25 摄氏度。
点击屏幕底部的图片、标题和按钮。取消勾选“Continue”复选框，然后点击“Start”步骤，为项目命名并保存。
现在将样品加载到流变仪平台上，并按照先前所述的一般测试方案开始测试。随后观察储能模量（G′）和损耗模量（G″）随时间的变化曲线，找到G′与G″的交点，确定该交点对应的时间。
然后点击“表格”，复制所有数据，并将其粘贴到一个文本文件中。