الصغير-الكشف (ميرناس) قصيرة (18 – 25 النيوكليوتيدات)، واحد-الذين تقطعت بهم السبل، وفضله الكشف التي تؤدي وظيفة المنظمين السلبية للتعبير الجيني على المستوى بوستترانسكريبشونال بتثبيط الحمض النووي الريبي الرسول (مرناً) ترجمة و/أو تعزيز تدهور مرناً 1-يتم نسخها ميرناس من إينترونس أو exons من الترميز أو المشقوق فضله، والجينات في النواة من دروشا، للسلائف ميرناس (ما قبل-ميرناس)، وهياكل الجذعية-حلقة قصيرة من النيوكليوتيدات 702. عقب هيولى الصادرات، وكذلك معالجة قبل ميرناس بواسطة ديسير في ميرناس الناضجة التي تمتد 18 – 25 النيوكليوتيدات3،4. وفي وقت لاحق، المجمع إسكات المستحثة بالحمض النووي الريبي (RISC) يتضمن هذه ميرناس كالكشف واحد-الذين تقطعت بهم السبل، الذي يسمح تجليدها إلى 3 'غير مترجمة منطقة (3'-UTR) بهم مرناس الهدف لقمع ما التعبير3،5 .
خلال العقود الثلاثة الماضية، حيث أنها قد حددت أولاً، ظهرت ميرناس للمنظمين سيد التعبير الجيني، ومستويات التعبير الخاصة التي هي أحكام الرقابة6. وقد وصف أدوار ميرناس في جهاز التنمية7،،من89،10،11،12، الحفاظ على التوازن13،14 ، فضلا عن سياقات المرض التي تشمل العصبية15،16،17،،من1819،20من القلب والأوعية الدموية، شروط المناعة الذاتية21 ،22،23،السرطان24وغيرها25. جلبت إلى الأمام الحاجة إلى أساليب الكشف عن موثوقية النصوص ميرنا التقدير المتزايد للأهمية أنماط التعبير ميرنا. وتشمل هذه الأساليب PCR الوقت الحقيقي، [ميكروارس]، النشاف الشمالية، والتهجين في الموقع وغيرها، التي تختلف في حساسية وخصوصية، وكمية الطاقة، معظمها يرجع ذلك إلى حقيقة أن النصوص ميرنا تتألف من قصيرة و 6من متواليات عالية مثلى.
ونحن أفادت مؤخرا دوراً هاما لميرنا-182 في التنمية لتضخم عضلة القلب26، شرط وصف التكيف الهيكلي للقلب في الاستجابة لمطالب الفسيولوجية مرتفعة27،28. تضخم القلب تتميز بالزيادة في كتلة عضلة القلب، التي، إذا ترافق مع مهايئ يعيد29، يمكن أن يؤدي إلى زيادة خطر الإصابة بقصور القلب، شرط المحاسبة 8.5 في المائة من جميع الوفيات المنسوبة إلى القلب والأوعية الدموية 30من المرض.
هنا، يمكننا وصف لنا البروتوكول الذي يجمع بين التهجين في الموقع مع مسبار الحمض النووي مؤمناً (حفر) (LNA) المسمى ديجوكسيجينين وإيمونوستاينينج للكشف عن جزيئات البروتين وميرنا على الماوس المقاطع أنسجة القلب، المتزامنة في موقعنا نموذج لتضخم القلب.
يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال ميكرورنا، من خلال توفير أدوات للكشف عن التكلس النسبي لكل من جزيئات البروتين والمجهر النوويRNA. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو أنه يمكنك الكشف عن كل من جزيئات البروتين والمجهر من نفس قسم الأنسجة. يبدأ هذا البروتوكول بإماهة الأنسجة المثبتة بالشريحة.
دافئة الشرائح في 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في فرن التهجين. يجب أن يكون البارافين يذوب بشكل واضح. ثم، احتضان الشرائح في جرة كوبلين الزجاج تحتوي على وكيل المقاصة المتاحة تجاريا لمدة 10 دقائق.
افعل هذا مرتين بعد ذلك، نقل الشرائح من غسل لغسل لإعادة الترطيب الأنسجة. مرة واحدة رطب، احتضان الأنسجة في محلول عمل البروتينات K في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
لإزالة البروتين K، قم بغسل الشرائح في برنامج تلفزيوني 1x مرتين. الآن، إصلاح الأنسجة. أولاً، جعل الخزانات على الشرائح باستخدام قلم مبيد للماء لرسم دائرة طاردة للماء حول الاستعدادات.
بعد ذلك، تطبيق 500 ميكرولترات من 4٪ PFA حل داخل الحاجز، واحتضان الشرائح في غطاء محرك الدخان. لإزالة المثبت، قم بغسل الشرائح في جرة كوبلين تحتوي على PBS لمدة خمس دقائق مرتين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بغسل الشرائح في 0.13 مُضَر 1-ميثيليميدزول لمدة 10 دقائق.
القيام بذلك في غطاء محرك الدخان في درجة حرارة الغرفة، وإجراء هذا الغسيل مرتين. أضف تثبيت EDC