micro-RNAs（miRNAs）是一类短链（18–25个核苷酸）、单链、非编码RNA，可通过抑制信使RNA（mRNA）的翻译和/或促进mRNA降解，在转录后水平负向调控基因表达1。miRNAs由编码或非编码基因的内含子或外显子转录而来，在细胞核内被DROSHA切割生成前体miRNAs（pre-miRNAs），后者为长约70个核苷酸的茎环结构2。pre-miRNAs经输出至细胞质后，由DICER进一步加工为成熟miRNAs，长度为18–25个核苷酸3,4。随后，RNA诱导的沉默复合体（RISC）将这些miRNAs以单链RNA形式整合，使其能够结合靶mRNA的3'非翻译区（3'-UTR），从而抑制其表达3,5。
在过去的三十年中，自首次被发现以来，miRNA 已逐渐成为调控基因表达的主导分子基因表达的调控因子，其自身的表达水平受到严格调控6. 已有研究描述了miRNA在器官发育中的作用7,8,9,10,11,12，稳态的维持13,14，以及包含神经学的疾病背景15,16,17,18,19心血管20，自身免疫性疾病21,22，癌症23,24以及其他人员25。随着人们对miRNA表达模式相关性认识的不断加深，对miRNA转录本可靠检测方法的需求日益凸显。这些方法包括实时PCR、微阵列、Northern印迹杂交， 原位 杂交等方法，这些方法在灵敏度、特异性和定量能力上存在差异，主要原因是miRNA转录本由短且高度同源的序列组成6.
我们最近报道了miRNA-182在心肌肥厚发展中的重要作用26，心肌肥厚是一种心脏在血流动力学负荷增加时发生的结构适应性改变27,28。心肌肥厚的特征是心肌质量增加，若伴随不良适应性重构29，则会增加心力衰竭的风险，而心力衰竭占所有心血管疾病相关死亡的8.5%30。
在此，我们描述了将以下内容结合的实验方案 原位 使用地高辛标记（DIG）的锁核酸（LNA）探针进行杂交，并结合免疫染色，以在小鼠心脏肥厚模型的心脏组织切片上同时检测miRNA和蛋白质分子。
该方法可通过提供检测蛋白质和微小RNA（microRNA）分子相对定位的工具，帮助解答微小RNA研究领域中的关键问题。该技术的主要优势在于，能够从同一组织切片中同时检测蛋白质和微小RNA分子。本实验方案首先对载玻片上的组织进行复水处理。
将载玻片置于杂交炉中，在 60 摄氏度下预热 10 分钟，此时石蜡应明显熔化。随后，将载玻片放入盛有市售透明剂的玻璃染色缸中，孵育 10 分钟。
重复此步骤两次。接着，将切片从一个洗涤液转移至另一个洗涤液，以重新水化组织。水化完成后，在37°C下用蛋白酶K工作液孵育组织15分钟。
为了去除蛋白酶K，用1× PBS将载玻片洗涤两次。现在固定组织。首先，使用疏水笔在样本周围绘制一个防水圈，以在载玻片上形成储液区。
接下来，在屏障内加入500微升4%PFA溶液，并将载玻片置于通风橱中孵育。为去除固定剂，将载玻片在盛有PBS的考普林瓶中室温下洗涤两次，每次5分钟。随后，将载玻片在0.13摩尔的1-甲基咪唑溶液中洗涤10分钟。
在室温下的通风橱中进行此操作，并重复洗涤两次。加入EDC固定剂，在通风橱中室温孵育一小时。用50毫摩尔的Tris冲洗载玻片。
为进行杂交实验做准备，首先构建一个加湿孵育盒。在盒子底部放入两张滤纸或擦镜纸，并用体积比为1:1的甲酰胺与1x SSC溶液浸湿。随后，向每张载玻片上加入200微升预热的杂交溶液，将载玻片放入加湿孵育盒中，在50摄氏度条件下孵育1至3小时。
孵育结束后，将杂交液替换为250微升探针溶液，并用无RNase的盖玻片覆盖载玻片。注意避免在盖玻片下残留气泡。随后，用封口膜小心密封杂交 chamber，并在比探针RNA熔解温度低约30摄氏度的条件下过夜孵育载玻片。
可能需要进行优化。除了设定合适的孵育温度外，不同的微小RNA表达水平不同，因此可能还需要针对探针浓度进行优化，以获得最佳信号。杂交完成后，进行严谨性洗涤。
首先，在 50 摄氏度的 2x SSC 中孵育五分钟，或直至盖玻片松动。然后，在室温下用 2x SSC 洗涤两次，每次五分钟。接着，在室温下继续操作，用 0.2x SSC 洗涤载玻片五分钟，随后在 PBST 中洗涤五分钟，最后在 1x PBS 中洗涤五分钟。
此时，RNA-RNA 杂交体已稳定，不再需要严格的 RNA 操作条件。进行 DIG 抗体检测时，首先修整疏水屏障，加入 500 微升封闭液，孵育 30 分钟。将切片置于湿盒中，室温下孵育。
接下来，移除封闭液，并加入500微升DIG抗体溶液。将切片置于湿盒中，室温孵育1小时。然后，使用考普林瓶在PBST中洗涤切片三次，每次5分钟。
接下来，用预染液将载玻片洗涤两次，每次五分钟。然后，将载玻片转移至聚丙烯载玻片邮寄罐中，并加入 20 毫升碱性磷酸酶底物溶液。现在，在 37 °C 条件下避光孵育 6 至 24 小时。
首次使用AP底物时，需密切观察反应过程。每