son micro-RNAs (miRNAs) corto (18 – 25 nucleótidos), ARN monocatenario, los que funcionan como reguladores negativos de la expresión génica a nivel post-transcripcional por inhibición de la traducción del ARN mensajero (ARNm) o promover la degradación del mRNA 1. miRNAs se transcriben intrones o exones de codificación o los genes y son troceados en el núcleo por DROSHA, miRNAs del precursor (pre-miRNAs), que son estructuras de corto lazo del vástago de 70 nucleótidos2. Después citoplásmica de la exportación, pre-miRNAs más son procesados por DICER en miRNAs maduros que abarcan 18 – 25 nucleótidos3,4. Posteriormente, el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC) incorpora estos miRNAs como ARN monocatenario, que permite su unión a la región 3' no traducida (3'-UTR) de sus mRNAs de destino para reprimir su expresión3,5 .
En las últimas tres décadas, puesto que primero fueron identificados, miRNAs han surgido para principales reguladores de la expresión génica, cuyos niveles de expresión están estrechamente controlados6. Papeles de miRNAs se han descrito en órgano desarrollo7,8,9,10,11,12, mantenimiento de la homeostasis13,14 , así como de contextos de enfermedad que incluyen neurológica15,16,17,18,19, cardiovascular20, condiciones autoinmunes21 ,22,23,de cáncer24y otros25. La apreciación creciente de la importancia de los patrones de expresión de miRNA ha presentado la necesidad de métodos de detección fiable de las transcripciones de miRNA. Tales métodos incluyen PCR de tiempo Real, microarrays, norte Blot, hibridación en situ y otros, que varían en sensibilidad, especificidad y potencia cuantitativa, predominante debido a que miRNA transcripciones se componen de corto y secuencias altamente homólogo6.
Nos informó recientemente un papel importante de miRNA-182 en el desarrollo de la hipertrofia del miocardio26, una condición que describe la adaptación estructural del corazón en respuesta a elevadas exigencias hemodinámicas27,28. Hipertrofia cardiaca se caracteriza por el aumento de la masa miocárdica, que, si asociado con remodelación desadaptativas29, puede llevar a un mayor riesgo para la insuficiencia cardíaca, una condición representan 8.5% de todas las muertes atribuibles a cardiovascular enfermedad30.
Aquí, describimos nuestro protocolo que combina en situ el hibridación con una sonda de ácido nucleico bloqueado (DIG) (LNA) y el immunostaining para la detección simultánea de moléculas miRNA y la proteína en secciones de tejido de corazón de ratón, marcados con digoxigenina en nuestro modelo de la hipertrofia cardiaca.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del microARN, proporcionando herramientas para detectar la relativa lcalización de moléculas de proteínas y microARN. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden detectar moléculas de proteínas y microARN de la misma sección tisular. Este protocolo comienza con una rehidratación de los tejidos montados en las diapositivas.
Caliente los portaobjetos a 60 grados centígrados durante 10 minutos en el horno de hibridación. La parafina debe derretirse visiblemente. A continuación, incubar los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio que contenga un agente de limpieza disponible comercialmente durante 10 minutos.
Haz esto dos veces. A continuación, transfiera los portaobjetos del lavado al lavado para rehidratar los tejidos. Una vez hidratados, incubar los tejidos en la solución de trabajo de proteinasa K a 37 grados Celsius durante 15 minutos.
Para eliminar la proteinasa K, lave los portaobjetos en 1x PBS dos veces. Ahora, arregla los tejidos. Primero, haz depósitos en los portaobjetos usando una pluma hidrófoba para dibujar un círculo repelente al agua alrededor de los preparativos.
A continuación, aplicar 500 m