מיקרו-RNAs (miRNAs) הם קצרים (18 – 25 נוקלאוטידים), RNAs חד-גדילי, noncoding המתפקדים הרגולטורים שלילי של ביטוי גנים ברמת post-transcriptional על ידי עיכוב תרגום RNA שליח (mRNA) ו/או קידום mRNA השפלה ¹. miRNAs הם עיבד אינטרונים או exons של קידוד או noncoding גנים והם ביקע בגרעין על-ידי DROSHA, כדי קודמן miRNAs (pre-miRNAs), אשר הם גזע-לולאת מבנים של נוקלאוטידים 70². בעקבות cytoplasmic לייצא, pre-miRNAs מעובדים נוספים על ידי לטעמים לתוך miRNAs בוגרת המתפרסים על פני 18 – 25 נוקלאוטידים³^,⁴. לאחר מכן, המתחם שתיקה RNA-induced (RISC) משלבת miRNAs האלה כמו RNAs חד-גדילי, המאפשר את הכריכה שלהם לאזור 3' לא מתורגם (3'-UTR) של mRNAs היעד שלהם כדי לדכא את הביטוי³^,⁵.

בתוך שלושה עשורים, מאז שהם זוהו קודם, miRNAs הופיעו על הרגולטורים מאסטר של ביטוי גנים, רמות הביטוי האישי שלו הם מגבילים⁶. תפקידים miRNAs תוארו אורגן פיתוח⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹², תחזוקה של הומאוסטזיס¹³^,¹⁴, כמו גם מחלות בהקשרים הכוללים נוירולוגיות¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹,²⁰לב וכלי דם, מחלות אוטואימוניות²¹ ^,²²,²³^,סרטן²⁴ועוד²⁵. הערכה הגוברת על הרלוונטיות של דפוסי ביטוי miRNA הביא קדימה את הצורך בשיטות זיהוי אמין של הפרוטוקולים miRNA. שיטות כאלה כוללות PCR בזמן אמת, מיקרו-מערכים, סופג בצפון, הכלאה בחיי עיר ועוד, אשר להשתנות רגישות, ירידה לפרטים, ובכוחו כמותית, בעיקר בשל העובדה כי miRNA תעתיקים המורכב מעובדים קצר ו רצפים הומולוגיים מאוד⁶.

לאחרונה דווח כאן תפקיד חשוב עבור miRNA-182 בפיתוח של שריר הלב היפרטרופיה²⁶, מצב המתארת הסתגלות מבנית של הלב בתגובה לדרישות מוגברות בגרימת²⁷^,²⁸. היפרטרופיה מאופיין על-ידי הגדלת מסת שריר הלב, אשר, אם המשויך שיפוץ maladaptive²⁹, יכול להוביל לסיכון מוגבר לאי ספיקת לב, תנאי החשבונאי 8.5% ממקרי המוות כל המיוחס לב וכלי דם מחלת³⁰.

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו המשלבת בחיי עיר הכלאה עם התווית על-ידי digoxigenin בדיקה (מחדירים) נעולים חומצת גרעין (מגבר קדם), immunostaining איתור בו-זמניות של מולקולות miRNA וחלבון במקטעי רקמת הלב העכבר, ב שלנו דגם של היפרטרופיה.

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום microRNA, על ידי מתן כלים כדי לזהות את lcalization היחסי של מולקולות חלבון ומיקרו-רנ"א. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאתה יכול לזהות הן מולקולות חלבון microRNA מאותו קטע רקמה. פרוטוקול זה מתחיל בהידרציה מחדש של הרקמות המותקנות על החלקה.

מחממים את השקופיות ב 60 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות בתנור ההכלאה. הפרפין צריך להיות נמס בעליל. לאחר מכן, הדגירה את המגלשות בצנצנת קופלין זכוכית המכילה חומר ניקוי זמין מסחרית במשך 10 דקות.

תעשה את זה פעמיים. לאחר מכן, להעביר את השקופיות מן לשטוף לשטוף כדי rehydrate את הרקמות. לאחר הידראט, דגירה את הרקמות פרוטאינאז K פתרון עבודה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.

כדי להסיר את proteinase K, לשטוף את השקופיות ב 1x PBS פעמיים. עכשיו, לתקן את הרקמות. ראשית, לעשות מאגרים על המגלשות באמצעות עט הידרופובי לצייר מעגל דוחה מים סביב ההכנות.

לאחר מכן, להחיל 500 microliters של פתרון 4%PFA בתוך המכשול, ו דגירה את השקופיות במכסה המנוע אדים. כדי להסיר את התיקון, לשטוף את השקופיות בצנצנת קופלין המכיל PBS במשך חמש דקות פעמיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות ב 0.13 טוחן 1-Methylimidazole במשך 10 דקות.

לעשות את זה במכסה המנוע אדים בטמפרטורת החדר, ולבצע לשטוף את זה פעמיים. מוסיפים את התיקון EDC, ו דגירה בטמפרטורת החדר במכס

MiRNA רקמות ספציפיות ביטוי פרופיל בהלב העכבר באמצעות סעיפים <em>באתרו של</em> הכלאה