micro-RNA (Mirna) è brevi (18 – 25 nucleotidi), singolo filamento, non codificanti RNA che fungono da regolatori negativi della espressione genica a livello post-trascrizionale inibendo la traduzione di RNA messaggero (mRNA) e/o promuovere la degradazione di mRNA 1. i miRNA sono trascritti da introni o essoni di codifica o di geni non codificanti e sono spaccati nel nucleo di DROSHA, al precursore Mirna (pre-miRNA), che sono strutture di breve gambo-ciclo di 70 nucleotidi2. Seguendo citoplasmico esportare, pre-miRNA vengono ulteriormente elaborati con DICER in Mirna maturi che si estendono su 18 – 25 nucleotidi3,4. Successivamente, il complesso di silenziamento indotto da RNA (RISC) incorpora questi miRNA come single-stranded RNA, che per il loro legame la regione 3' non tradotta (3'-UTR) del loro mRNA bersaglio consente di sopprimere la loro espressione3,5 .
Negli ultimi tre decenni, poiché in primo luogo sono stati identificati, Mirna sono emerse al Maestro regolatori dell'espressione genica, i cui livelli di espressione sono strettamente controllato6. Ruoli per i miRNA sono stati descritti in organo sviluppo7,8,9,10,11,12, mantenimento della omeostasi13,14 , così come contesti di malattia che includono neurologico15,16,17,18,19, cardiovascolare20, patologie autoimmuni21 ,22, cancri23,24e altri25. Il crescente apprezzamento per la rilevanza dei modelli di espressione di miRNA ha portato avanti la necessità di metodi di rilevazione affidabili delle trascrizioni di miRNA. Tali metodi includono la Real Time PCR, microarray, Northern Blotting, ibridazione in situ e altri, che variano per la sensibilità, la specificità e la potenza quantitativa, principalmente dovuto al fatto che miRNA trascrizioni sono costituite da brevi e sequenze altamente omologhe6.
Recentemente abbiamo segnalato un importante ruolo dei miRNA-182 nello sviluppo dell'ipertrofia del miocardio26, una condizione che descrive l'adeguamento strutturale del cuore in risposta a richieste emodinamiche elevati27,28. L'ipertrofia cardiaca è caratterizzata dall'aumento della massa miocardica, che, se associato con rimodellamento maladattativo29, può condurre al rischio aumentato per insufficienza cardiaca, una condizione pari al 8,5% di tutti i decessi attribuibili a cardiovascolare malattia30.
Qui, descriviamo il nostro protocollo che combina l'ibridazione in situ con sonda di acido nucleico (DIG) bloccato (LNA) e immunostaining per la rilevazione simultanea di miRNA e proteina molecole su sezioni di tessuto di cuore di topo, digoxigenin-labeled in nostro modello dell'ipertrofia cardiaca.
Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nel campo dei microRNA, fornendo strumenti per rilevare la relativa lcalizzazione delle molecole di proteine e microRNA. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile rilevare molecole di proteine e microRNA dalla stessa sezione tissutale. Questo protocollo inizia con una reidratazione dei tessuti montati sul vetrino.
Riscaldare gli scivoli a 60 gradi Celsius per 10 minuti nel forno di ibridazione. La paraffina dovrebbe sciogliersi visibilmente. Quindi, incubare le diapositive in un barattolo di coplin di vetro contenente agente di compensazione disponibile in commercio per 10 minuti.
Fallo due volte. Successivamente, trasferire le diapositive dal lavaggio al lavaggio per reidratare i tessuti. Una volta idratato, incubare i tessuti nella soluzione di lavoro proteinasi K a 37 gradi Celsius per 15 minuti.
Per rimuovere la proteinasi K, lavare le diapositive in 1x PBS due volte. Ora, aggiusta i tessuti. In primo luogo, creare serbatoi sugli scivoli usando una penna idrofobica per disegnare un cerchio idrorepellente intorno ai preparati.
Successivamente, applicare 500 microlitri di soluzione di PFA al 4% all'interno d