マイクロ Rna (Mirna) は短い (18-25 のヌクレオチド)、単一座礁させた、非コード Rna メッセンジャー RNA (mRNA) の翻訳を抑制することおよび/または mRNA の分解促進により転写レベルでの遺伝子発現の負の制御因子として機能します。1。 miRNAs はイントロンやコーディングのエクソンから転写されるまたは非コード遺伝子と切断 70 ヌクレオチド2の短い茎ループ構造は、前駆体 miRNAs (pre-Mirna) に DROSHA、による核。次の細胞質をエクスポート、プレは 18-25 のヌクレオチド3,4にまたがる成熟 Mirna にダイサーによってさらに処理されます。その後、RNA によるサイレンシング複合体 (RISC) として組み込まれていますこれらの Mirna 一本鎖 Rna を式3,5 を抑制するため、3' 非翻訳領域 (3' UTR)、ターゲット Mrna に結合可能.
最後の三十年に彼らが最初に識別されたので、遺伝子発現、その独自の表現のレベルが厳しく制御された6のマスター調節因子に Mirna が登場しました。Mirna の役割は、臓器開発7,8,9,10、11,12、恒常性1314,のメンテナンスに記載されています。、病気コンテキスト神経15,16,17,18,19, 心血管20, を含む自己免疫条件21 だけでなく、 ,22癌23,24,25。MiRNA 発現パターンの関連性の増加の感謝は前方マイクロ Rna 転写産物の信頼性の高い検出法の必要性をもたらしています。このようなメソッドなどリアルタイム PCR、マイクロ アレイ、北にしみが付くことの in situハイブリダイゼーション、miRNA のトラン スクリプトは短いから成るという事実のために主に感度、特異性、定量的な力で変化して高い相同配列の6。
我々 は最近、miRNA-182、心筋肥大26、高架の血行力学的要求27,28に応えて心臓の構造的に適応を記述する条件の開発の重要な役割を報告しました。心臓肥大は不適応改造29に関連付けられている場合は、会計 8.5% すべての死のために起因する心血管の条件、心不全のリスク増加につながることができる心筋の量の増加によって特徴付けられる病気30。
ここで、ジゴキシゲニン標識 (DIG) ロックされた核酸 (LNA) プローブとマウス心臓ティッシュ セクションのマイクロ Rna とタンパク質分子の同時検出用免疫染色での in situハイブリダイゼーションを組み合わせた私たちのプロトコルを説明私たち心臓肥大のモデル。
この方法は、タンパク質およびマイクロRNA分子の両方の相対lcalizationを検出するツールを提供することにより、microRNA分野の主要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、同じ組織セクションからタンパク質とマイクロRNA分子の両方を検出できることです。このプロトコルは、スライドマウント組織の水分補給から始まります。
ハイブリダイゼーションオーブンで10分間摂氏60度でスライドを温めます。パラフィンは目に見えて溶けているはずです。次いで、市販のクリアリング剤を含有するガラスコプリンジャーにスライドを10分間インキュベートする。
これを2回行います。次に、洗浄から洗浄するためにスライドを移して組織を水分補給します。水和したら、プロテイナーゼKの働く溶液中の組織を摂氏37度で15分間インキュベートします。
プロテナーゼKを除去するために、スライドを1倍PBSで2回洗浄する。さて、組織を修正します。まず、疎水性ペンを使用してスライド上に貯水槽を作り、製剤の周りに撥水円を描きます。
次に、バリア内に4%PFA溶液の500マイクロリットルを塗布し、ヒュームフードにスライドをインキュベートします。固定剤を取り除くために、PBSを含むコプリン瓶でスライドを室温で2回5分間洗います。次に、0.13モル1-メチルイミダゾールで10分間スライドを洗浄します。
室温でフームフードでこれを行い、この洗浄を2回行います。EDC固定剤を加え、ヒュームフードで室温で1時間インキュベートします。スライドを50ミリモルトリスですすいでください。
ハイブリダイゼーションの準備をするために、まず加湿チャンバーを構築します。フィルターまたはティッシュペーパーを2枚を箱の底に積み込み、ホルムアミドと1x SSCの1対1の混合物で紙を濡らします。次に、各スライドに200マイクロリットルの事前温めハイブリダイゼーション溶液を塗布し、加湿したチャンバーを摂氏50度で1〜3時間インキュベートします。
インキュベーション後、ハイブリダイゼーション溶液を250マイクロリットルのプローブ溶液に交換し、スライドをRNaseフリーカバースリップで覆います。カバースリップの下に気泡をトラップしないようにしてください。さて、チャンバーをパラフィルムで丁寧に密封し、プローブのRNA融解温度より約30°C以下でスライドを一晩インキュベートします。
最適化が必要な場合があります。適切なインキュベーション温度の設定に加えて、異なるマイクロRNAが異なるレベルで発現されるため、最適な信号を得るためにプローブ濃度に関する最適化が必要になる場合があります。ハイブリダイゼーションに続いて、ストリンジェンシーの化しを行う。
まず、5分間摂氏50度で2倍のSSCに入ったか、またはカバースリップが緩むまでであった。次いで、室温で2倍のSS