마이크로 RNAs (miRNAs)는 짧은 (18-25의 뉴클레오티드), 단일 가닥, noncoding RNAs는 메신저 RNA (mRNA) 번역 억제 및 홍보 mRNA 저하 여 post-transcriptional 수준에서 유전자 발현의 부정적인 레 귤 레이 터 기능 1. miRNAs는 introns 또는 코딩의 exons에서 복사할 수 또는 noncoding 유전자와 전조 miRNAs (pre-miRNAs), 70 뉴클레오티드2의 짧은 줄기 루프 구조를 DROSHA에 의해 핵에서 죽 습. 세포질 다음 내보내기, 사전 miRNAs 더 성숙한 miRNAs는 18-25의 뉴클레오티드3,4로 DICER에 의해 처리 됩니다. 그 후, RNA 유도 입을 복잡 한 (RISC) 통합이 miRNAs 단일 가닥 RNAs로 그들의 식3,5 억제 하는 3' 되지 않은 지역 (3'-UTR) 그들의 표적 mRNAs의 바인딩을 수 있는 .
그들은 처음으로 확인 했다, 이후 지난 3 년간 내 miRNAs가 유전자 발현, 그 자신의 식 레벨은 긴밀 하 게 제어6의 마스터 레 귤 레이 터 등장 했습니다. 장기 개발7,,89,10,11,12, 항상성13,14의 유지 보수에에서 miRNAs에 대 한 역할 설명 되었습니다. , 질병 컨텍스트 신경15,,1617,18,19, 심혈 관20를 포함 하는 자기 면역 조건21 뿐만 아니라 ,22, 암23,24, 등25. MiRNA 식 패턴의 관련성에 대 한 증가 감사 미르 증명서의 신뢰할 수 있는 검출 방법에 대 한 필요성을 게 앞으로 가져왔다. 이러한 방법 등이 실시간 PCR, microarrays, 북부에 게 더 럽 히기, 제자리에서 교 잡, 사실은 미르 성적표는 짧은 구성 주로 감도, 특이성, 및 양적 발전에 따라 고 매우 일치 순서6.
우리는 최근 미르-182 심근 비 대26, 높은 hemodynamic 요구27,28응답에서 심장의 구조적 적응을 설명 하는 조건 개발에 대 한 중요 한 역할을 했다. 심장 비 대 maladaptive 개장29와 관련 된 경우 심장 마비, 회계 모든 죽음의 8.5%에 기인 심장 혈관 상태에 대 한 위험 증가에 지도할 수 있는 심근 질량에 있는 증가 의해 특징입니다. 질병30.
우리가 현장에서 교 잡은 digoxigenin 표시 (발굴) 잠겨 핵 산 (LNA) 프로브와 결합 마우스 심장 조직 단면도에 미르와 단백질 분자의 동시 검출을 위한 immunostaining에 우리의 프로토콜을 설명 하는 여기, 우리의 심장 비 대의 모델입니다.
이 방법은 단백질과 microRNA 분자 모두의 상대적 lcalization을 검출하는 도구를 제공함으로써 microRNA 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 동일한 조직 섹션에서 단백질과 microRNA 분자를 모두 검출할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 슬라이드 장착 조직의 재수화로 시작됩니다.
하이브리드화 오븐에서 슬라이드를 섭씨 60도에서 10분간 데우십시오. 파라핀은 눈에 띄게 녹아야 합니다. 그런 다음, 10 분 동안 시판 가능한 클리어링 에이전트를 포함하는 유리 코플린 항아리에 슬라이드를 배양.
두 번 이 작업을 수행합니다. 다음으로 슬라이드를 세척에서 세척으로 옮겨 조직을 수화합니다. 수분을 공급하면 단백질AE K 작업 용액의 조직을 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다.
단백질제 K를 제거하려면 슬라이드를 1x PBS로 두 번 세척합니다. 지금, 조직을 해결합니다. 첫째, 소수성 펜을 사용하여 슬라이드에 있는 저수지를 만들어 준비 주위에 발수 원을 그립니다.
다음으로, 장벽 내에 4%PFA 용액의 500마이크로리터를 적용하고 슬라이드를 연기 후드에 배양합니다. 고정을 제거하려면 실온에서 PBS가 들어있는 코플린 항아리에서 슬라이드를 실온에서 2 회 2 회 2 회 세척하십시오. 다음으로, 0.13 어금니 1-메틸리미다졸레로 슬라이드를 10분간 세척합니다.
실온에서 연기 후드에이 작업을 수행하고, 두 번 세척을 수행합니다. EDC 고정을 추가하고 연기 후드의 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오. 50 밀리머 트리스와 함께 슬라이드를 헹구십시오.
혼성화를 준비하기 위해 먼저 가습 챔버를 구축하십시오. 두 개의 필터 또는 티슈 페이퍼를 상자 바닥에 적재하고 포름아미데와 1x SSC의 일대일 혼합물로 종이를 적십니다. 다음으로, 각 슬라이드에 미리 따뜻워진 혼성화 용액 200마이크로리터를 적용하고, 50°C에서 1~3시간 동안 슬라이드의 가습 챔버를 배양한다.
인큐베이션 후 하이브리드화 솔루션을 250마이크로리터의 프로브 솔루션으로 교체하고 슬라이드를 RNase 프리 커버 슬립으로 덮습니다. 커버 슬립 아래에 기포가 포획되지 않도록 하십시오. 이제 파라필름으로 챔버를 조심스럽게 밀봉하고 프로브의 RNA 용융 온도 보다 약 섭씨 약 30도에서 밤새 슬라이드를 배양합니다.
최적화가 필요할 수 있습니다. 올바른 인큐베이션 온도를 설정하는 것 외에도 상이한 microRNA가