Micro-RNAs (miRNAs) zijn korte (18-25 nucleotiden), single-stranded, noncoding RNAs die als negatieve regelgevers van genexpressie op post-transcriptional niveau functioneren door remming van de boodschapper-RNA (mRNA) vertaling en/of bevordering van de aantasting van het mRNA 1. miRNAs zijn transcriptie van introns of exons van codering of noncoding genen en zijn in de nucleus door DROSHA, aan de voorloper van miRNAs (pre-miRNAs), die korte stam-lus structuren van 70 nucleotiden2gekloofd. Na cytoplasmatische exporteren, pre-miRNAs zijn verder verwerkt door DICER tot volwassen miRNAs die zich uitstrekken van 18-25 nucleotiden3,4. Vervolgens neemt het RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC) deze miRNAs als single-stranded RNAs, die het mogelijk voor hun binding aan de 3' niet-vertaalde regio (3'-UTR) van hun doel mRNAs maakt te onderdrukken hun expression3,5 .
Binnen de laatste drie decennia, aangezien ze voor het eerst werden geïdentificeerd, miRNAs opgedoken aan meester regelgevers van genexpressie, wiens eigen expressie niveaus strak gecontroleerde6 zijn. Rollen voor miRNAs zijn beschreven in orgel ontwikkeling7,8,9,10,11,12, onderhoud van homeostase13,14 , evenals ziekte contexten waarin neurologische15,16,17,18,19, cardiovasculaire20, auto-immune voorwaarden21 ,22, kankers23,24, e.a.25. De toenemende appreciatie voor de relevantie van miRNA expressiepatronen heeft de behoefte aan betrouwbare detectiemethoden van miRNA afschriften naar voren gebracht. Dergelijke methoden omvatten Real Time PCR, microarrays, het noordelijke bevlekken, in situ hybridisatie en anderen, die in de gevoeligheid, specificiteit en kwantitatieve macht, overwegend verschillen wijten aan het feit dat de miRNA Transcripten bestaan uit korte en zeer homologe reeksen6.
Onlangs meldden wij een belangrijke rol voor miRNA-182 in de ontwikkeling van de myocardiale hypertrofie26, een aandoening met een beschrijving van de structurele aanpassing van het hart in reactie op verhoogde hemodynamische eisen27,28. Hypertrofie van het hart wordt gekenmerkt door de toename van de myocardiale massa, die indien gekoppeld maladaptieve remodelleert29, kan leiden tot verhoogd risico op hartfalen, een aandoening die goed voor 8,5% van alle sterfgevallen toe te schrijven aan cardiovasculaire ziekte30.
Hier beschrijven we onze protocol dat in situ hybridisatie combineert met een heksenkruid-label (DIG) vergrendeld Nucleic Acid (LNA) sonde en immunokleuring voor de gelijktijdige detectie van miRNA en eiwit moleculen op muis hart weefselsecties, in onze model voor hypertrofie van het hart.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het microRNA-veld, door het verstrekken van tools om de relatieve lcalisatie van zowel eiwit- als microRNA-moleculen te detecteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat u zowel eiwit- als microRNA-moleculen detecteren uit dezelfde weefselsectie. Dit protocol begint met een rehydratie van de op de glijbaan gemonteerde weefsels.
Verwarm de glijbanen op 60 graden Celsius gedurende 10 minuten in de hybridisatieoven. De paraffine moet zichtbaar smelten. Vervolgens, inculbateren van de dia's in een glazen Coplin pot met commercieel beschikbare clearing agent voor 10 minuten.
Doe dit twee keer. Breng vervolgens de glijbanen van wassen om te wassen om de weefsels te hydrateren. Eenmaal gehydrateerd, incubeer de weefsels in proteinase K werkoplossing op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten.
Om de proteinase K te verwijderen, was je de glijbanen twee keer in 1x PBS. Repareer de weefsels. Maak eerst reservoirs op de glijbanen met behulp van een hydrofobe pen om een waterafstotende cirkel rond de preparaten te trekken.
Breng vervolgens 500 microliters van 4%PFA-oplossing aan in de barrière en broed de glijbanen