микро РНК (интерферирующим) являются короткие (18-25 нуклеотидов), одноцепочечной, некодирующей РНК, которые функционируют как негативные регуляторы экспрессии генов на post-transcriptional уровне путем ингибирования матричная РНК (мРНК) перевод и/или содействия деградации мРНК 1. интерферирующим расшифрованный от интронов или экзонов кодирования или некодирующей генов и являются расщепляется в ядре, DROSHA, чтобы прекурсоров интерферирующим (pre адаптивной), которые являются короткий стебель циклические структуры 70 нуклеотидов2. После цитоплазматических экспорта, pre адаптивной Далее перерабатывается DICER в зрелых адаптивной, которые охватывают 18-25 нуклеотидов3,4. Впоследствии РНК-комплекс (RISC) включает в себя эти интерферирующим как одноцепочечной РНК, которая позволяет для их привязки к 3' непереведенные региона (3'-УТР) их целевых мРНК подавить их выражение3,5 .

В течение последних трех десятилетий так как они впервые были определены, адаптивной появились мастер регуляторы экспрессии генов, чьи собственные уровни выражения являются жестко контролируемой6. Роли для адаптивной были описаны в орган развития7,8,9,10,11,12, поддержание гомеостаза13,14 , а также болезни контексты, которые включают неврологические15,16,,1718,19, сердечно-20, аутоиммунных условия21 ,22, рака23,24и другие25. Увеличение признательность за актуальность структур Мирна выражение выдвинули необходимость надежного обнаружения методов Мирна стенограмм. Такие методы включают реальном масштабе времени PCR, microarrays, Северный Blotting, в situ Гибридизация и другие, которые различаются в чувствительность, специфичность и количественные власти, преимущественно с тем, что Мирна стенограммы состоят из коротких и 6высоко гомологичных последовательности.

Недавно мы сообщили важную роль для Мирна-182 в развитие гипертрофии миокарда26, условие, описывая структурной адаптации сердца в ответ на повышенный гемодинамики требования27,28. Гипертрофии сердца характерно увеличение массы миокарда, который, если связанные с неадаптивные ремоделирования29, может привести к повышенному риску развития сердечной недостаточности, условие, приходится 8,5% всех смертей объясняется сердечно-сосудистой системы болезни30.

Здесь мы описываем наш протокол, который сочетает в себе в situ гибридизация с надписью digoxigenin (DIG) Locked нуклеиновой кислоты (LNA) зонд и иммуноокрашивания для одновременного обнаружения Мирна и белковых молекул на разделах ткани сердца мыши, в нашем модель гипертрофии сердца.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микроРНК, предоставляя инструменты для обнаружения относительной икализации молекул белка и микроРНК. Основным преимуществом этой техники является то, что вы можете обнаружить как белок и молекулы микроРНК из той же части ткани. Этот протокол начинается с регидратации тканей, установленных на слайдах.

Разогрейте горки при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 10 минут в духовке гибридизации. Парафин должен заметно таять. Затем инкубировать слайды в стеклянной банке Coplin, содержащей коммерчески доступный клиринговый агент в течение 10 минут.

Сделай это дважды. Затем перенесите слайды с мытья на стирку для регидратации тканей. После увлажнения, инкубировать ткани в proteinase K рабочий раствор при 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут.

Чтобы удалить протеиназу K, мыть слайды в 1x PBS два раза. Теперь почини ткани. Во-первых, сделать резервуары на слайдах с помощью гидрофобной ручкой, чтобы нарисовать водоотталкивающий круг вокруг препаратов.

Затем нанесите 500 микролитров раствора 4%PFA в пределах барьера и инкубировать горки в дымовой капот. Чтобы удалить фиксатор, мыть горки в банке Coplin содержащие PBS в тече