Chemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
تحليل البروتين أبنية ومجمعات البروتين-يجند بالتكامل الهيكلي الكتلي
Chapters
Summary October 15th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
الطيف الكتلي (MS) برز كأداة هامة للتحقيق في بنية وديناميات الجزيئات التجميعات. هنا، نحن إدماج النهج المستندة إلى MS استجواب تشكيل البروتين المعقدة وملزم يجند.
Transcript
في الوقت الحاضر ، يلعب قياس الطيف الكتلي دورًا مهمًا في علم الأحياء الهيكلي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الجزيئات الحيوية الحيوية الهامة في حالتها الأصلية ، وخاصة البروتينات ومجمعات البروتين. قياس الطيف الكتلي الأصلي ينطبق على نطاق واسع على مجموعة متنوعة من الجمعيات الجزيئية الحيوية بما في ذلك أنظمة متعددة المواد وحمض النوى.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها سريعة وحساسة للغاية. ويمكن استخدامه لاستجواب عينات البروتين غير المتجانسة، وجعل من الممكن لتحليل البروتينات متعددة في الدولة القلة في وقت واحد. إثبات الإجراء سيكون (أندي لاو) طالب دكتوراه في مجموعتي
لبدء هذا الإجراء، إعداد الشعيرات الدموية في المنزل ل nanoelectrospray كما هو موضح في بروتوكول النص. إعداد عينة خالية من ليجند كتحكم لكل تشغيل كتبادل المخزن المؤقت كل في خلات الأمونيوم. بعد ذلك، حدد الحساسية، اقتناء الأيونات الإيجابية، وسائط TOF للتنقل.
بدوره التالي على فخ ، و API ، وغازات IMS. لفصل الدردشة استخدام النيتروجين وargon نقطة البداية هو مبين هنا وضبط حسب الضرورة. تعيين نطاق اقتناء م / ض مناسبة.
بالنسبة لبروتين غير معروف يجب أن تستخدم خطوات التحسين الأولية نطاقًا واسعًا. أدخل الشعيرات الدموية المغلفة بالذهب في حامل شعري. ثم تحميل بين اثنين وثلاثة ميكرولترات من محلول البروتين المعقدة من الفائدة في الشعرية.
شد بلطف الشعرية ووضعها على مرحلة مصدر رذاذ كهربائي. قم بزلاق المرحلة إلى موضع لبدء الحصول على البيانات. تطبيق ضغط الغاز تدفق نانو منخفضة حتى شكل قطرة في غيض من شعري.
نقل الشعرية فيما يتعلق مخروط ورصد التيار أيون لتحقيق تيار أيون مستقرة. تطبيق الجهد الشعري في نطاق يتراوح بين 0.9 و 1.6 كيلوفولت. ثم تعيين مخروط أخذ العينات، إزاحة المصدر، درجة حرارة المصدر، وتدفق الغاز المخروطي كما هو مبين في بروتوكول النص.
للحصول على طيف كتلة محسومة وانتقال أيونات مُعظم، قم بضبط معلمات التصلب المتعدد وراقب التغير الناتج في الأطياف. تعيين الطاقة الاصطدام فخ إلى نقطة انطلاق أولية بين 10 و 50 فولت. إذا كانت إزاحات الجهد غير كافية، ضبط الطاقات الاصطدام فخ.
تعيين فخ عن طريق الجهد إلى نقطة انطلاق أولية بين 20 و 45 فولت. تحسين desolvation عن طريق تحسين هذا الجهد. بعد ذلك، تحسين سرعة الموجة وارتفاع الموجة كما هو موضح في النص لتحقيق أفضل فصل التنقل.
في الدراسات التي تنطوي على HerA و NurA استخدام سرعة الموجة من 40 مترا في الثانية وارتفاع الموج بين 550 و 650 فولت. لتحليل ربط الحمض النووي، اخلط البروتين والحمض النووي بنسبة حورية تسمح بتكوين معقد للحمض النووي البروتيني. إضافة كميات متزايدة من أي من التالية، 5'O-3-thio-ثلاثي الفوسفات، ملح رباعي اليثيوم، أو ADP.
باستخدام البرمجيات المناسبة قياس الجماهير من الأنواع المولدة وتحديد ملزمة ليغاند، مثل ATP و ADP ملزمة والدول القلة. ثم استخدام كثافة الأيونات التي لوحظت في أطياف MS ESI الخام لتحديد كمية الوفرة النسبية المقابلة للأنواع. بعد تحسين ظروف الأداة لنقل مستقر، والحد من الطاقة الاصطدامية ومخروط أخذ العينات منخفضة قدر الإمكان، مع الاحتفاظ بجودة الأطياف الجيدة.
استخدم السرعة المحسنة للموجة التي تم تحديدها مسبقًا وارتفاع الموجة للحصول على IM MS. قياس الوقت الانجراف الأيون في ثلاث سرعات موجة مختلفة مع الحفاظ على ارتفاع الموجة نفسها. لتحديد البروتين أيون CCS قياس أربعة كاليبرانت البروتين, اثنين مع كتلة فوق البروتين قيد التحقيق واثنين مع كتلة أدناه, باستخدام نفس الشروط الأجهزة. أولاً، إعداد عينات البروتين والتخزين المؤقت تبادلها في خلات الأمونيوم كما هو مبين في بروتوكول النص.
إضافة المذيبات في 10٪ زيادات حتى الوصول إلى المبلغ المطلوب. احتضان على الجليد لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك، الحصول على طيف IM MS لكل عينة.
باستخدام برنامج SUMMIT ، تعيين المكونات الفرعية للبروتين وتوليد شبكات التفاعل البروتين. بدلا من ذلك، توليد يدويا قائمة من الجماهير النظرية للأنواع المتوقعة. للبدء في التحقيق في الاستقرار البروتين المعقد، سجل بيانات IM-MS مع زيادة الجهد تسارع فخ من 10 فولت إلى 200 فولت، والتي سوف تتكشف تدريجيا إلى مرحلة البروتين والغاز.
تحليل البيانات باستخدام البرامج المناسبة وتوليد المؤامرات تتكشف ثنائية الأبعاد عن طريق التراص توزيعات CCS تطبيع كثافة في كل الجهد المتسارع لكل دولة تهمة. تكشف نتائج مرض التصلب العصبي المتعدد الأصلي عن حالة القلة وتكوينها وطبولوجيا مجمع HerA و NurA. كما يتم الحفاظ على التفاعلات غير التكافؤ في مرحلة الغاز، MS الأصلي من ATP غاما S و ADP التجارب المعايرة، وتستخدم لتحديد ربط النيوكليوتيدات زوج الحكيمة في HerA و NurA.
تكشف الأطياف الكتلية لدول هيرا أوليجومير أن زيادة تركيزات أُكات جاما S تزيد من الكثافة النسبية للهيرا سداسية. ثم تستمد القيم التجريبية CCS للبروتينات ومجمعاتها من تجارب IM-MS. وينظر إلى هذه القيم على أنها تتفق بشكل جيد مع القياسات النظرية من التصوير البلوري بالأشعة السينية، والتي تؤكد صحة استخدام قيم احتجاز ثاني أكسيد الكربون وتخزينه لبناء نماذج منخفضة الدقة لتجميع البروتين.
تحليل CIU وKEcom يكشف عن أن الحمض النووي ملزمة HerA-NurA هو أكثر استقرارا من مجمع خالية من الحمض النووي. تحليل CIU MS و حالات ربط ATP المعنية يظهر أن أربعة ATP جاما S دولة ملزمة يقلل الاستقرار المعقدة في مرحلة الغاز. ومع ذلك، فإن الستة ATP غاما S دولة ملزمة التي يتم فيها شغل جميع المواقع، وينظر إلى أن تكون الأكثر استقرارا.
توفر القياسات الدقيقة للكتلة الجزيئية لمجمع سليم رؤية قيمة في توصيف الجزيئات الحيوية. يمكننا الحصول على معلومات عن مسارات التجميع المعقدة ، oligomerization البروتين ، وملزمة ليغاند. الجمع بين كل هذه المعلومات يسمح لتوليد نماذج مفصلة من الجمعيات البيولوجية الوظيفية.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
