Chemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Protein mimarileri ve Protein-Ligand komplekslerinin bütünleştirici yapısal kütle spektrometresi tarafından analiz
Chapters
Summary October 15th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Kütle spektrometresi (MS) yapısı incelenmesi ve makromoleküllerin derlemeler dinamikleri için önemli bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Burada, protein kompleksi oluşumu ve ligand sorgulamaya MS tabanlı yaklaşımlar entegre.
Transcript
Günümüzde kütle spektrometresi yapısal biyolojide önemli bir rol oynamaktadır. Bu yöntem, doğal durumları olan önemli biyolojik makromoleküller, özellikle proteinler ve protein kompleksleri ile ilgili anahtar soruların yanıtlatına yardımcı olabilir. Yerli kütle spektrometresi, multiprotein ve nükleik asit sistemleri de dahil olmak üzere çeşitli biyomoleküler derlemeler için yaygın olarak uygulanabilir.
Bu tekniğin en büyük avantajı hızlı ve son derece hassas olmasıdır. Heterojen protein örneklerini sorgulamak, aynı anda oligomerik durumda birden fazla proteinin analiz edilmesi mümkün kılmak için kullanılabilir. Prosedürü gösteren Andy Lau, grubumda bir doktora öğrencisi olacak.
Bu yordamı başlatmak için, metin protokolünde belirtildiği gibi nanoelectrospray için şirket içi kılcal damarları hazırlayın. Amonyum asetat içine tampon değişimi her çalıştırmak için bir kontrol olarak ligand-free örnek hazırlayın. Ardından, duyarlılık, pozitif iyon edinimi ve mobilite TOF modlarını seçin.
Bir sonraki açma da tuzak, API ve IMS gazları. IM ayırma için burada gösterilen azot ve argon başlangıç noktalarını kullanın ve gerektiği gibi ayarlayın. Uygun bir m/z edinme aralığı ayarlayın.
Bilinmeyen bir protein için ilk optimizasyon adımları geniş bir yelpazede kullanmalıdır. Altın kaplı kılcal damarı bir kılcal tutucuya takın. Daha sonra kapiller içine ilgi protein kompleksi çözeltiiki ve üç mikrolitre arasında yükleyin.
Kılcal damarı hafifçe sıkın ve elektrosprey kaynak aşamasına yerleştirin. Veri elde etmeye başlamak için sahneyi konuma getirin. Kılcal damarın ucunda bir damla oluşana kadar düşük nano akışlı gaz basıncı uygulayın.
Kılcal damarı koniye göre hareket ettirin ve kararlı bir iyon akımı elde etmek için iyon akımını izleyin. 0,9 ile 1,6 kilovolt arasındaki aralıkta kılcal bir voltaj uygulayın. Ardından, metin protokolünde belirtildiği gibi örnekleme konisini, kaynak ofsetini, kaynak sıcaklığını ve koni gaz akışını ayarlayın.
İyi çözülmüş bir kütle spektrumu ve maksimum iyon iletimi elde etmek için, MS parametrelerini ayarlayın ve spektrumdaki sonucu olan değişimi izleyin. Tuzak çarpışma enerjisini 10 ile 50 volt arasında bir başlangıç noktasına ayarlayın. Gerilim uzaklıkları yetersizse, tuzak çarpışma enerjilerini ayarlayın.
20 ve 45 volt arasında bir başlangıç noktasına kendi gerilimi ile tuzak ayarlayın. Bu voltajı optimize ederek desolvasyonu artırın. Bundan sonra, en iyi hareketlilik ayrımı elde etmek için metinde belirtildiği gibi dalga hızı ve dalga yüksekliği optimize edin.
HerA ve NurA içeren çalışmalar için saniyede 40 metre ve 550 ve 650 volt arasında bir dalga yüksekliği bir dalga hızı kullanın. DNA bağlayıcı analizi için, protein ve DNA'yı protein DNA kompleksi oluşumuna izin veren molar oranında karıştırın. Aşağıdakilerden herhangi birini artırarak ekleyin, 5'O-3-thio-trifosfat, tetralithium tuz, veya ADP.
Uygun yazılım kullanarak üretilen türlerin kitleleri ölçmek ve ligand bağlayıcı, ATP ve ADP bağlayıcı ve oligomerik devletler gibi belirlemek. Daha sonra türlerin karşılık gelen göreceli bolluk ölçmek için ham ESI MS spektrumlarında gözlenen iyon yoğunluklarını kullanın. Kararlı şanzıman için alet koşullarını optimize ettikten sonra, çarpışma enerjisini ve örnekleme konisini mümkün olduğunca düşük bir şekilde azaltırken, iyi spektrum kalitesini korur.
IM MS'i elde etmek için önceden belirlenmiş en iyi leştirilmiş dalga hızını ve dalga yüksekliğini kullanın. Aynı dalga yüksekliğini korurken iyon sürüklenme süresini üç farklı dalga hızlarında ölçün. Protein iyon CCS ölçmek için dört protein kalibrasyon ölçmek, araştırma altında protein yukarıda kütlesi ile iki ve aşağıdaki kitle ile iki, aynı enstrümantasyon koşulları kullanarak. İlk olarak, protein örneklerini hazırlayın ve tampon olarak metin protokolünde belirtildiği gibi amonyum asetat asetat içine değiştirin.
İstenilen miktara ulaşana kadar %10'luk artışlarla çözücü ekleyin. Bir saat buzda kuluçkaya yat. Bundan sonra, her örnek için bir IM-MS spektrumu edinin.
Summit yazılımını kullanarak, protein alt kompleksleri atayın ve protein etkileşim ağları oluşturun. Alternatif olarak, el ile beklenen türler için teorik kitlelerin bir listesini oluşturmak. Protein kompleksi stabilitesini araştırmaya başlamak için, tuzak ivme gerilimini artırırken IM-MS verilerini kaydedin ve tuzak ivme gerilimini 10 volttan 200 volta yükseltin, bu da protein ve gaz fazına aşamalı olarak açılacaktır.
Verileri uygun yazılımı kullanarak analiz edin ve her bir şarj durumu için her hızlanan voltajda şiddeti normalleştirilmiş CCS dağılımlarını istifleyerek iki boyutlu açılma çizimlerini oluşturun. Yerli MS sonuçları HerA ve NurA kompleksinin oligomerik durumunu, bileşimini ve topolojisini ortaya koymaktadır. Gaz fazında kovalent olmayan etkileşimler korunduğundan, ATP gamma S ve ADP titrasyon deneylerinin yerli MS'i HerA ve NurA'daki çift yönlü nükleotit bağlanmasını belirlemek için kullanılır.
HerA oligomerik hallerinin kütle spektrumları ATP gama S konsantrasyonunun artırılmasının hexameric HerA'nın göreceli yoğunluğunu artırdığını ortaya koymaktadır. Proteinler ve kompleksleri için deneysel CCS değerleri daha sonra IM-MS deneylerinden elde edilir. Bu değerlerin, düşük çözünürlüklü protein montaj modelleri oluşturmak için CCS değerlerinin kullanılmasını doğrulayan x-ışını kristalografisinin teorik ölçümleri ile iyi bir uyum içinde olduğu görülmektedir.
CIU ve KEcom analizleri DNA'ya bağlı HerA-NurA'nın DNA içermeyen kompleksten daha kararlı olduğunu ortaya koymaktadır. CIU MS analizi ve ilgili ATP bağlama durumları, dört ATP gama S bağlı durumunun gaz fazında karmaşık stabiliteyi azalttığını göstermektedir. Ancak, tüm sitelerin işgal edildiği altı ATP gama S bağlı devlet, en kararlı olduğu görülmektedir.
Bozulmamış bir kompleksin moleküler kütlesinin doğru ölçümleri biyomoleküler karakterizasyonuna dair değerli bilgiler sağlar. Karmaşık montaj yolları, protein oligomerizasyonu ve ligand bağlanması hakkında bilgi alabiliriz. Tüm bu bilgilerin birleştirilmesi fonksiyonel biyolojik derlemeler ayrıntılı modeller oluşturmak için izin verir.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
